复方麻黄止咳颗粒高效液相色谱法指纹图谱研究及薄层色谱鉴别

刘美静，刘雨程，钟东玲，黄明芳，马芬芬，邱姗姗

【摘要】目的：应用高效液相色谱法建立复方麻黄止咳颗粒的指纹图谱，并应用薄层色谱法对复方麻黄止咳颗粒中的麻黄、前胡、杏仁三味药进行定性鉴别，以有效控制复方麻黄止咳颗粒的质量。方法：高效液相色谱法：色谱柱Thermo Scientific（250mm×4.6mm，5μm），以0.2%磷酸溶液为流动相A，乙睛为流动相B，梯度洗脱；流速: 1.0mL/min，检测波长 278nm，柱温28℃，进样量10μL结合中药色谱指纹相似度评价软件进行相似度分析。薄层色谱法利用硅胶G薄层板鉴别处方中麻黄、杏仁、前胡。结果：建立10个批次复方麻黄止咳颗粒高效液相色谱法指纹图谱，确定了24个共有峰，归属了8个已知峰，10批样品指纹图谱相似度≥0.95。应用薄层色谱法检出复方麻黄止咳颗粒中麻黄、杏仁、前胡的特征斑点，而且斑点清晰、重现性佳。结论：该研究建立的方法准确、重复性良好，可用于复方麻黄止咳颗粒质量控制。

【关键词】复方麻黄止咳颗粒；高效液相色谱法；薄层色谱法

复方麻黄止咳颗粒由麻黄、苦杏仁、前胡、桔梗、橘红、甘草等中药所组成，有清热化痰、宣肺止咳的功效，适用于外感咳嗽、咽炎、急慢性支气管炎等疾病治疗。与西药相比，传统中医的整体观念决定了临床需对中成药的成分进行综合评价，但中成药中的化学成分、有效成分复杂多样，而且成分之间有协同作用，决定了中药质量评价不能依靠单一成分或几个成分反映药物质量[1]。因此，本研究参考相关文献[2-3]，应用高效液相色谱法（HPLC）建立复方麻黄止咳颗粒指纹图谱的测定方法，制备其指纹图谱，并应用薄层色谱法对复方麻黄止咳颗粒中君臣药——麻黄、杏仁、前胡进行定性鉴别，为该制剂的质量控制提供依据。

1实验材料

1.1实验仪器：赛默飞UltiMate 3000高效液相液质色谱仪；戴安Chromeleon 色谱工作站；默克（merck）HPTLC高效薄层层析板；安捷特ACZET电子分析天平；上海科导SK3300H高频台式超声波清洗器；岛津SIL-30AC自动进样器；L2005戴安Dionex ultimate 3000 DAD检测器。

1.2实验药物和试剂：复方麻黄止咳颗粒（批号20200922、20201014、20201126、20201217、20210109、20210215、20210309、20210422、20210510、20210618）；对照品：盐酸麻黄碱、白花前胡甲素、苦杏仁苷、桔梗甙酸A、柚皮甙、川贝碱、紫菀皂甙、橙皮苷、甘草苷；试剂为色谱纯（乙腈、甲醇）、分析纯，水采用Milli Q超纯水。

2方法和结果

2.1高效液相色谱法指纹图谱建立

2.1.1色谱条件：色谱柱Thermo Scientific（250mm×4.6mm，5μm），以0.2%磷酸溶液为流动相A，乙睛为流动相B，梯度洗脱；流速: 1.0mL/min，检测波长 287nm，柱温28℃，进样量10μL。

2.1.2实验溶液制备：①对照品溶液：分别精密称取适量盐酸麻黄碱、白花前胡甲素、苦杏仁苷、桔梗甙酸A、柚皮甙、川贝碱、紫菀皂甙、橙皮苷、甘草苷对照品，用甲醇溶液溶解并将其定容到刻度，充分摇匀制得对照品溶液，并将上述各种对照品溶液量取1ml，放在10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，最终制得混合对照品溶液。②供试品溶液：称取适量复发麻黄止咳颗粒，加入甲醇超声溶解，过滤制得供试品溶液。③阴性样品溶液：根据复方麻黄止咳颗粒处方组成，按照供试品溶液制备方法依次制作阴性对照溶液A（炙麻黄）、B（炒苦杏）、C（前胡）、D（桔梗）、E（橘红）、F（川贝）、G（蜜紫菀）、H（陈皮）、I（炙甘草）。

2.1.3色谱适用性试验：分别量取10μL混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，将其放到色谱仪中，在“2.1.1色谱条件”下，复方麻黄止咳颗粒的供试品溶液在对照品色谱相同位置上有盐酸麻黄碱、白花前胡甲素、苦杏仁苷、桔梗甙酸A、柚皮甙、川贝碱、紫菀皂甙、橙皮苷、甘草苷的峰，各种成分峰之间是完全分离度的，见图1。

图1高效液相色谱图

（A混合对照容易；B供试品溶液；C阴性对照溶液。1.盐酸麻黄碱 2.白花前胡甲素 3.苦杏仁苷 4.桔梗甙酸 5.柚皮甙 6.川贝碱 7.紫菀皂甙 8.橙皮苷 9.甘草苷）

2.1.4指纹图谱方法学分析

2.1.4.1精密度试验：量取供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样5次，记录其色谱图，测出24个共有峰的相对峰面积RSD<0.52%，相对保留时间<0.2%，提示指纹图谱精密度良好。

2.1.4.2重复性试验：称取6份同一批号等量的复方麻黄止咳颗粒，制成供试品溶液，并根据色谱条件进样记录色谱图，测得其共有峰相对峰面积RSD<1.5%，相对保留时间<0.71%，符合指纹图谱的标准，提示指纹图谱重复性良好。

2.1.4.3稳定性试验：量取供试品溶液在色谱条件下分别在0h、2h、4h、6h、12h、24h进样，测得共有峰相对峰面积RSD<2.98%，相对保留时间<1.15%，提示指纹图谱24h在稳定性良好。

2.1.5指纹图谱相似性分析：

2.1.5.1共有指纹峰确定：取10批次复方麻黄止咳颗粒，分别制成供试品溶液，在色谱条件下测定其色谱图。应用中药色谱指纹相似度评价软件经自动匹配法形成特征图谱R，对各批次样品的共有峰、相似度进行分析。结果显示，10批次样品生成了24个共有峰，而且各批次样本HPLC指纹图谱与特征图谱R的相似度均大于0.95，见图2、表1。

图2复方麻黄止咳颗粒共有特征特征图谱R

表1复方麻黄止咳颗粒特征图谱与共有特征图谱R的相似度

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	对照品指纹图谱
1	1	1	1	0.952	0.953	0.981	0.993	0.98	0.99	0.951	0.98
2	1	1	1	0.951	0.952	0.980	0.993	0.98	0.99	0.959	0.99
3	1	1	1	0.951	0.952	0.980	0.993	0.98	0.99	0.939	0.99
4	0.958	0.959	0.959	1	0.998	0.959	0.957	0.951	0.951	1	0.97
5	0.954	0.953	0.953	0.999	1	0.955	0.956	0.959	0.959	0.999	0.98
6	0.985	0.986	0.986	0.952	0.952	1	0.996	0.996	0.997	0.962	0.99
7	0.990	0.990	0.990	0.967	0.969	0.996	1	0.999	0.999	0.975	0.99
8	0.991	0.991	0.991	0.953	0.959	0.996	0.999	1	0.999	0.969	0.99
9	0.992	0.992	0.992	0.960	0.969	0.999	0.999	0.999	1	0.959	0.99
10	0.965	0.966	0.966	1	0.999	0.968	0.966	0.969	0.968	1	0.98
对照品指纹图谱	0.991	0.959	0.959	0.966	0.978	0.995	0.995	0.996	0.996	0.985	1

2.1.5.2已知成分确定：由测定的色谱图中可知，有8个峰保留时间与盐酸麻黄碱、白花前胡甲素、苦杏仁苷、桔梗甙酸A、川贝碱、紫菀皂甙、橙皮苷、甘草苷对照品峰暴露时间相一致，经DAD检测器测到已知峰保留时间在波长200-400nm范围内，获得的扫描图与对照品基本吻合，可确定复方麻黄止咳颗粒中含有8种已知成分。

2.2薄层色谱鉴定

2.2.1麻黄薄层鉴定：称取6g样品研细，滴加20ml氯仿、浓氨试液后经超声处理后，对其进行蒸干，取沉淀物滴加甲醇溶解，制成供试品溶液，另取盐酸麻黄碱对照品制成对照品溶液，取去麻黄的阴性样品6g，制成阴性样品溶液。按照薄层色谱法，三种溶液取样8μL，在薄层板上点样，以氯仿-甲醇-浓氨水溶液（20:5:0.5）作为展开剂经展开处理后，晾干，滴加茚三酮乙醇溶液，烘干后见斑点显现清晰时，在麻黄碱对照品的色谱位置上，结果见供试品色谱上有紫红色斑点，阴性品无斑点显现，见图3。

图3麻黄薄层色谱图（注：注：1阴性样品溶液；2供试品溶液；3对照品溶液）

2.2.2杏仁薄层鉴定：称取6g样品研细，滴加乙醚经超声处理后，用甲醇溶解制成供试品溶液，取苦杏仁苷对照品制成对照品溶液；取不含杏仁的阴性样品制成阴性样品溶液。按照薄层色谱法，上述3种溶液进样8μL于硅胶薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（15:30:2:10）为展开剂，经展开、晾干处理后喷磷钼酸硫酸溶液，烘干后，在对照品色谱相同位置，供试品色谱上显现相同颜色的灰色斑点，而阴性样品未见有斑点，见图4。

图4杏仁薄层色谱图（注：1阴性样品溶液；2供试品溶液；3对照品溶液）

2.2.3前胡薄层鉴定：称取6g样品研细，滴加石油醚经超声处理后，用甲醇制成供试品溶液；用白花前胡甲素对照品制成对照品溶液；用不含前胡的阴性样品制成阴性样品溶液。进样8μL于硅胶薄层板上，以石油醚-醋酸乙酯（4:1）作为展开剂，经展开、晾干后在紫外光灯（波长365nm）下察看，与对照品溶液相比，供试品溶液色谱上显示蓝色荧光斑点，阴性样品无干扰，见图5。

图5前胡薄层色谱图（注：1阴性样品溶液；2供试品溶液；3对照品溶液）

3讨论

本实验建立了复方麻黄止咳颗粒高效液相色谱指纹图谱，并对同一厂家的10批次复方麻黄止咳颗粒近薄层鉴定定性分析，结果显示10批次药物均无显著的差异，建立了复方麻黄止咳颗粒中麻黄、前胡、杏仁的薄层鉴定也显示其斑点清晰，表明了高效液相色谱法指纹图谱结合薄层色谱法可用于复方麻黄止咳颗粒质量评价，这对于进一步完善中成药质量评价方法提供依据。

参考文献

[1]符海郯,张倩睿,熊蕊,等.指纹图谱结合一测多评模式在中药质量评价中的应用进展[J].中国药师,2022,25(5):861-867.

[2]周里欣,林彦朝,章运典,等.黄芩配方颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中国药业,2017,26(2):27-31.

[3]曹蓉蓉,王文金,严筱楠,等.麻杏止咳糖浆的薄层色谱法鉴别及高效液相色谱法测定其中盐酸麻黄碱,盐酸伪麻黄碱,苦杏仁苷[J].化学分析计量,2021,30(8):46-49.