纸片法测定粪大肠菌群影响因素的探讨

李杰 ,罗水强

摘要：在水质监测中，粪大肠菌群作为反映水体环境卫生状况的重要指标而备受关注，目前粪大肠菌群的测定方法有多管发酵法和快速纸片法，两者均满足要求，但由于纸片法操作便捷、耗时较短、影响因素少等优势被广泛运用。通过对方法规范中样品保存温度、保存时间以及培养时间等因素进行控制分析，并进行结果分析，为水质监测总大肠菌群测定提出建议。

关键词：纸片法  粪大肠菌群  水质监测  影响因素

近年来，环境问题备受关注，国家主席习近平指出绿水青山，就是金山银山。地方相关主管部门为了掌握“绿水”水质，积极开展河流、水库等水质监测工作，以监测数据作为评判水质好坏，分析污染物特征，为水体污染治理提供依据。粪大肠菌群是一类长期存在于人体粪便中革兰氏阴性的无芽孢杆菌，可作为水体受粪便污染的指示菌，水质监测中对粪大肠菌群的监测具有重要的环境卫生意义。环境问题被抬到了新高度，环境检测公司如雨后春笋，爆发式增长，但检测技术参差不齐，故此次研究快速纸片法测定水中粪大肠菌群具有一定意义。

一、方法原理

将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2，3，5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（44℃）培养24 h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲麟（TTF），即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有总大肠菌群或粪大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应总大肠菌群或粪大肠菌群的浓度值。

二、仪器设备名称及型号

恒温培养箱（37±1℃） GH4500

高压灭菌锅（121℃、103kpa） LDZX-50KBS

车载冰箱（-18℃~﹢10℃） 英德尔

移液枪（10±0.1ml、1±0.01ml） 赛默飞

微生物检测纸片 环凯微生物

三、方法步骤

《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法》（HJ 755-2015）方法主要包含样品采集、样品保存、接种、培养、结果判读记录等步骤。本次实验人员在规范要求下，通过改变样品保存的温度、样品保存时间、培养时长等变量，进而研究这些因素对最终测定总大肠菌群数的影响。

3.1样品保存温度对测定结果的影响

方法要求采样后2h内检测，否则，需10℃以下冷藏并不得超过6h。水质监测过程中，采样到实验室收样耗时一般远超过2h，故前者实用性较差，多选用在后者，即在10℃以下冷藏并不超过6h完成测定。在河流同一断面、相同位置和深度下采集4瓶水样，分别在0℃、5℃、10℃、常温（32℃）下保存4h，每个样均做平行实验（平行样不计算标准变差，只作为一种辅助质量控制），在44℃下培养24h，记录实验结果。

3.2 样品保存时长对测定结果的影响

在河流同一断面、相同位置和深度下采集4瓶水样，在5℃冰箱中冷藏2h、4h、6h、8h、12h后进行实验，每个样均做平行实验，在37℃下培养24h，记录实验结果。

3.3 培养时长对测定结果的影响

在河流断面采集1瓶水样，在5℃冰箱中冷藏4h，按规范接种培养平行样，在培养16h、18h、21h、24h、26h后分别记录实验结果。

四、结果分析

4.1 样品保存温度对测定结果的影响

样品类别	保存温度	接种量（mL）	MPN/L	均值
地表水	0℃	1、0.1、0.01	2.4×103	2.25×103
		1、0.1、0.01	2.1×103
	5℃	1、0.1、0.01	2.8×103	2.45×103
		1、0.1、0.01	2.1×103
	10℃	1、0.1、0.01	2.7×103	2.55×103
		1、0.1、0.01	2.4×103
	32℃	1、0.1、0.01	5.2×103	4.95×103
		1、0.1、0.01	4.7×103
无菌水（空白）	/	10、1、0.1	＜20	＜20
大肠埃希氏菌	/	10、1、0.1	阳性	阳性
金黄色葡萄球菌	/	10、1、0.1	阴性	阴性

此次实验，空白对照、阳性及阴性对照均满足规范要求，该次样品测定有效。分析不同保存温度对测定结果的影响：样品在10℃及以下保存时，随着保存温度的增高，测定结果有所增大，但整体变化幅度不大，加之本方法测定结果是一组统计学数据，故认为10℃及以下保存时，实验测定结果波动在正常区间内。当保存温度为大气温度（32℃）时，测定结果较10℃下保存时测定结果翻倍，影响了测定结果。在一定区间内，温度增高，有利于粪大肠菌群的生长繁殖。

4.2 样品保存时长对测定结果的影响

样品类别	保存时长	接种量（mL）	MPN/L	均值
地表水	2h	1、0.1、0.01	3.4×103	4.2×103
		1、0.1、0.01	5.0×103
	4h	1、0.1、0.01	5.2×103	5.1×103
		1、0.1、0.01	5.0×103
	6h	1、0.1、0.01	5.9×103	5.3×103
		1、0.1、0.01	4.7×103
	8h	1、0.1、0.01	7.6×103	7.25×103
		1、0.1、0.01	6.9×103
	12h	1、0.1、0.01	1.2×104	1.35×104
		1、0.1、0.01	1.5×104
无菌水（空白）	/	10、1、0.1	＜20	＜20
大肠埃希氏菌	/	10、1、0.1	阳性	阳性
金黄色葡萄球菌	/	10、1、0.1	阴性	阴性

此次实验，空白对照、阳性及阴性对照均满足规范要求，该次样品测定有效。当保存温度为5℃，保存时长为规范规定6h以内时，实验结果趋于稳定、一致。当保存时长大于6h时，随着保存时长的增加，实验测定结果增大。可知，当样品保存时长超过规范规定时长时，会给实验测定结果带来一定影响，影响结果准确性。

4.3 培养时长对测定结果的影响

样品类别	培养时长	接种量（mL）	MPN/L	均值
地表水	16h	1、0.1、0.01	2.7×103	2.75×103
		1、0.1、0.01	2.8×103
	18h	1、0.1、0.01	3.3×103	3.25×103
		1、0.1、0.01	3.2×103
	21h	1、0.1、0.01	3.3×103	3.45×103
		1、0.1、0.01	3.6×103
	24h	1、0.1、0.01	4.0×103	3.8×103
		1、0.1、0.01	3.6×103
	26h	1、0.1、0.01	1.7×104	1.21×104
		1、0.1、0.01	7.2×103
无菌水（空白）	/	10、1、0.1	＜20	＜20
大肠埃希氏菌	/	10、1、0.1	阳性	阳性
金黄色葡萄球菌	/	10、1、0.1	阴性	阴性

此次实验，空白对照、阳性及阴性对照均满足规范要求，该次样品测定有效。当样品培养温度为44℃时，培养时长为16h，小于方法规定最低培养时长18h时，测定结果偏小，但影响幅度不是很大；当培养时长在18~24h时，测定结果正常区间内变化；当培养时长为26h，超过方法规定最高培养时长时，测定结果增大幅度较大，使得实验测定结果值偏高。

五、结论及建议

通过此次实验得知，样品保存温度、保存时长以及培养时长都对本方法测定实验结果有所影响，在标准方法规定的区间内，测定结果均符合要求。利用纸片法测定粪大肠菌群时，应严格按照标准要求执行，特别注意样品保存温度、保存时长等因素，规范操作，减少人为误差。

参考文献

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[3] 张会强,徐锦岳,张秦铭,等. 四种检验水中粪大肠菌群标准方法的对比研究[J]. 山东化工,2019,48(4):67-72.

[4] 何敏,张亚娟,周艳红,等.水中粪大肠菌群检测方法的对比 [J].净水技术, 2018(09):27-30.