水产养殖环境中抗生素抗性基因污染及其研究进展

张玉磊

摘要：抗生素在防治水产生物细菌性疾病方面发挥了明显作用，而且对促进养殖生物的生长具有积极意义，因而抗生素在水产养殖中被广泛使用。

关键词：水产养殖；抗生素；抗性基因

抗生素作为一类抗菌剂，广泛用于治疗人与动物的细菌性疾病，被用作畜牧业和水产养殖业中的饲料添加剂，以促进养殖生物的生长及病害防控。但抗生素的吸收利用率低，70%抗生素随着人体代谢而排入水环境。水环境中的抗生素残留会导致细菌产生耐药性，形成抗生素抗性基因(ARGs)，可能加速超级细菌的产生，严重威胁公共健康安全。

一、水产养殖环境中抗生素抗性基因的来源与扩散

1、来源。当前，微生物中ARGs检出率不断增加，引起人们注重抗生素的使用与ARGs产生的关联。养殖业长期滥用抗生素导致养殖动物肠道内产生抗性菌株，环境中ARGs的主要来源是这些编码抗生素抗性基因的菌株。水产养殖环境中的不同环境介质中存在多种耐药菌及ARGs。抗性菌株主要随养殖动物粪便等代谢物进入环境，然后通过不同扩散方式进入地表水、大气、土壤或渗入地下水。环境中抗生素和抗性细菌浓度较低，但ARGs一旦进入环境微生物体内，就可通过质粒交换在基因水平上转移，传播ARGs，增加了ARGs在不同环境介质中迁移和传播的可能性。迄今为止，在养殖场废水和污水处理厂等不同环境介质中，已发现并报道了ARGs包括10种内酰胺抗性基因、4种磺胺抗性基因、39种四环素抗性基因、多种喹诺酮类抗性基因。其中，磺胺类、喹诺酮类抗性基因是水产养殖中检出率较高的主要基因。ARGs的来源大致分为：

①内在抗性。环境中ARGs主要来源之一是细菌的“内在抗性”，它是指通常在细菌基因组中不表达的抗性基因、准抗性基因、抗性基因原型，细菌通过表达潜在的抗性基因或随机突变获得抗性。此外，一些ARGs在自然界中早已存在，而不是因使用抗生素造成。有学者从冻土中筛选出新的氯霉素抗性基因，表明ARGs也存在于远离人类活动的地区。随着测序技术的快速发展，对环境中许多细菌的基因组、宏基因组学进行了测序及分析。研究发现，环境中存在大量不同种类的ARGs，还有与其水平转移相关的基因元件。随着环境中抗生素残留水平的不断提高，可诱导细菌自身抗性基因突变，加速水平转移。形成的ARGs可通过水平转移或其他方式进入人体，最终对人体健康构成危害。

②外源输入。环境中ARGs的一个重要来源是抗性细菌通过人畜粪便，与肠道细菌排出进入水环境。在当前养殖业中，各种兽药抗生素的消耗量不低于医疗领域抗生素的消耗量，有时甚至远超过人类用于治疗疾病的剂量。每年约有2400万t抗生素用于畜牧业，其中约70%以亚治疗剂量添加到饲料中，以促进生长。研究表明，用添加抗生素的饲料喂养养殖生物，一定时间后养殖生物体重增长量比未添加抗生素相比，提高了4～5%。然而，在用于预防和治疗细菌感染与促进养殖动物快速生长的抗生素中，只有15%被吸收利用，其余未被代谢，随着排泄物直接或间接排放到环境中，环境中微生物受到胁迫而诱导产生抗性，同时，肠道中耐药性细菌从体内排出后，其携带的遗传信息可通过横向转移机制存在于可转移质粒上，增加了自身迁移传播能力，并转移到外部环境中的微生物，然后转移到养殖水产品中。目前，关于地表水体、污水、饮用水中抗性菌株和ARGs检出与污染的报道较常见。此外，研究发现，不受人类活动影响的水环境中ARGs浓度明显低于受人类活动干扰的区域，表明抗生素抗性的产生与抗生素的使用和残留环境选择压力密切相关。水产养殖废水与畜牧业废水中的抗性基因种类及浓度较高，这些抗性基因可能对人类健康造成潜在危害。

2、传播扩散方式。水产养殖是ARGs进入水环境最直接的方式。在水产养殖区的养殖动物体内、水体与底泥中均有ARGs检出，表明水产养殖中抗生素的大量使用，使水产养殖区成为ARGs的存储库。抗生素能直接投加到水体中，还可通过饲料和养殖动物粪便间接进入水体。这些ARGs可能通过水平基因转移扩散到其他微生物体内，也可能通过食物链垂直传递，最终进入动物或人类肠道。

二、抗生素抗性基因研究方法

1、传统微生物抑制法。在传统微生物方法中，主要通过系统抗性表型来描述抗性大小，然后通过相关检验明确细菌种类，以了解抗生素抗性基因的宿主特征，从而更好地掌握抗生素抗性基因来源和传播途径。在传统研究方法中，微生物培养是主要研究方法，主要基于最小抑制浓度药敏试验，该方法可评估抗生素对微生物的抑制作用。抗生素含量越高，对微生物群落的抑制作用越大。

2、分子生物学技术。近年来，随着分子生物学技术和分子示踪技术的快速发展优化，为抗生素抗性基因的研究应用提供了先进的科学技术。①PCR技术。其是聚合酶链式反应的简称，主要是一种生物学技术，可快速和选择性地扩增生物体外的特定DNA片段分子，无需预先分离培养，有效简化了试验程序，减少了环境因素的干扰。②宏基因组学。它是在环境样本中克隆DNA并为其寻找合适载体的研究方法，并加入宿主菌进行筛选，得到目的基因并进行测序分析。宏基因组学能有效检测新的抗性基因。

三、抗生素抗性基因存在的问题

1、相关分析体系尚未建立，缺乏科学的监测方法。虽然PCR在抗生素抗性基因方面完全取代了传统的微生物培养方法，但PCR技术本身存在许多局限性，如提取的模板DNA纯度、退火温度、DNA聚合酶活性等，进一步影响检测结果，导致最终结果不够精确；实时荧光定量PCR技术受到多种物体的影响，尤其是引物二聚体。因二聚体是非特异性退火和延伸产物，对扩增效率有显著影响，并且在反应体系中与特异性产物竞争，降低了实时荧光定量PCR的敏感度；随着科技的不断发展，越来越多研究者将一般荧光定量PCR方法应用于水产养殖中抗生素抗性基因的定量研究，取得了良好效果，但该方法对抗生素抗性基因分类有很强的限制，从而限制了人们对抗生素抗性基因种类的认知范围。

2、目前，我国尚未对各类抗生素抗性基因来源、分布、传播进行相关研究分析，缺乏抗生素抗性基因相关数据和详细资料。

3、在水产养殖环境中，我国对抗生素抗性基因相关对策研究还不够充分，所以当前抗生素抗性基因在特定外部条件但在不同环境中的介质降解机理应被视为需亟待解决的重要研究问题，以便更好地阻碍抗生素抗性基因在当前环境中的进一步扩散。

四、抗生素抗性基因策略

1、建立监测分析水产养殖中抗生素抗性基因的相关体系，并加大新型污染物关注度。

2、利用高通量PCR技术，分析不同水产养殖环境介质中多种分类抗生素抗性基因在整个养殖周期中的时空变化，以及多种环境因子对抗生素抗性基因传播扩散的影响，并在实践中模拟这一过程，研究抗生素抗性基因在特定养殖环境中的传播扩散规律，更好地制定相关制约对策，有效控制抗生素抗性基因的扩散。

3、从不同水平角度，研究分析抗生素抗性基因对养殖环境中微生物种类和分布的影响、环境微生物群落进化机制、微生物之间的转移机理等。然后找到有效的处理技术，以减少废水，特别是养殖业废水中抗性菌株和抗生素抗性基因的丰度。

4、分析养殖环境中抗生素抗性基因的主要来源和分布。明确我国水产生殖环境中重要抗生素抗性基因污染区域、具体类型、污染程度，并建立抗生素抗性基因污染数据库，详细记录。

参考文献：

[1]罗义.水产养殖环境中抗生素抗性基因(ARGs)的研究及进展[J].生态毒理学报，2016，4(06):770-779．