非无菌药品生产企业洁净车间环境微生物鉴定及分析应用

邱莎，曾博

摘要：为了健全制药企业的环境微生物控制方案，为企业的风险评估提供借鉴和指导，本研究通过16SrRNA测序方式鉴定某制药企业洁净车间环境微生物，建立了环境微生物信息数据库，为企业偏差调查以及污染溯源分析提供非常有价值的信息，从而对企业有效的洁净环境及表面消毒与清洁方案提供更有力的技术支撑。通过调查洁净车间的环境微生物分布情况，发现污染源主要来源于人、设备、水，应采取有效的措施控制这些污染源，即能更好的保证药品质量。

关键词：16SrRNA；环境微生物信息数据库；溯源分析

微生物污染是影响药品质量和引发临床药品危害的重要原因之一[7]，根据相关报道[6]，2004-2011年间，因微生物污染被美国FDA召回的事件共642起，且逐年呈增加趋势，这些召回事件中涉及到的产品类型药品占比26%，因此预防和避免微生物对药品生产车间的污染是保证药品质量安全的重要手段。

通过对洁净室空气、表面和人员中的细菌进行长期监测，揭示药品生产企业洁净区微生物群落的分布特征，分析洁净区微生物群落的构成及筛选出优势菌株，用于研究更有效的消毒方法，为质量管理人员提供可靠的数据参考。

本研究通过收集一家非无菌药品生产企业洁净车间环境微生物，并进行鉴定，建立了覆盖整个药品生产过程的生产环境微生物数据库，为该车间后续微生物污染溯源分析提供了数据基础，对企业环境控制和风险评估有重要的意义。

1仪器与试药

微生物培养箱BXP-280S（上海博讯），实时荧光定量PCR检测系统CFX Connect（美国BIORAD公司），水平电泳仪及凝胶成像分析系统 (德国耶拿)

胰酪大豆胨琼脂培养基购于广东环凯微生物科技有限公司，Premix Taq (TaKaRa Taq  Version 2.0 plus dye) 购于TaKaRa。细菌采用 16SrRNA 通用扩增引物 27F 和 1492R，以上引物均购于生工生物工程 (上海)股份有限公司，引物序列见表 1。

表1引物序列表

引物名称                      序列

27F               5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′ 1492R             5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT3′

2 方法

2.1菌种的收集

与企业共同商定生产及储存环境的监控方案，其中监测环境包括称量室、充填室、混合室、内包室、洁净工艺走廊内包材暂存室及内包材暂存室等相关环境。通过使用胰酪大豆胨琼脂培养基收集环境中的沉降菌株，并将其分离培养纯化后进行鉴定。同时对分离纯化出的菌株35%甘油保存，作为环境微生物监测库。

2.2菌种的鉴定

在本研究中，菌株主要通过对微生物的16SrRNA测序并比对的方式进行鉴定。首先，挑取已经分离纯化后的菌株到10µl ddH2O中，然后通过100℃裂解10分钟，取上清作为PCR模板，取PCR模板2µl，Premix Taq 25µl，上游引物1µl，下游引物1µl，ddH2O 21µl，然后以下列程序进行PCR，94℃预变性10min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环 ，72℃再循环5min。PCR完成后将产物送至生工生物工程 (成都)股份有限公司进行测序，测序结束后将结果通过National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中的BLAST进行菌株的比对鉴定，获得相应的菌株信息。本研究共收集到275株环境微生物（见表2），

表2某药企洁净车间环境微生物统计表

监控项目鉴定数量/株 占比/％

称量室                             16                                 5.8 充填室                             25                                 9.1 混合室                             31                                 11.3 内包室                             68                                 24.7 洁净工艺走廊                       56                                 20.4 内包材暂存室                       12                                 4.4 制粒室                             24                                 8.7 其它                               43                                 15.6 共计                               275                                100

3结果及讨论

3.1环境微生物分布情况

本研究表明，某药企洁净车间中占比最高的菌群是革兰氏阳性球菌（50.9%），包括葡萄球菌属和库克菌属，其次为革兰氏阳性杆菌（22.9%），如芽孢杆菌属、微杆菌属及气球菌属，还有革兰氏阴性杆菌（21.5%），如假单胞菌属及不动杆菌属。某药企的微生物鉴定统计结果见表3，其中葡萄球菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、库克菌属均为占比最高的4种微生物，4种微生物之和占比为77.1%。在葡萄球菌属中，共分离到科氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等7种葡萄球菌，具体情况见表4。通过对某药企的持续采样，收集到洁净车间环境的微生物，通过16SrRNA扩增和测序鉴定，初步建立了此药企的洁净车间环境微生物数据库。

表3某药企洁净车间环境微生物鉴定结果统计

菌株（属）    株数 占比/％

葡萄球菌                             108                              39.3 芽孢杆菌                             36                               13.1 假单胞菌                             39                               14.2 库克菌                               29                               10.5 不动杆菌                             20                               7.3  微杆菌                               19                               6.9 气球菌                               8                                2.9 奈瑟菌                               3                                1.1 微球菌                               3                                1.1 其它                                 10                               3.6   共计                                 275                              100

表4某药企洁净车间环境中葡萄球菌属分布

菌株    株数 占比/％

科氏葡萄球菌                       53                                49.1 溶血葡萄球菌                       20                                18.5   表皮葡萄球菌                       9                                 8.3 人葡萄球菌                         8                                 7.4 山羊葡萄球菌                       8                                 7.4 腐生葡萄球菌                       6                                 5.6 头状葡萄球菌                       4                                 3.7 共计                               108                               100

3.2葡萄球菌属分布情况

在比对结果中显示所占比例最大的为葡萄球菌属，且该菌属在所有房间中均有发现，这种菌属无鞭毛，不能运动且无芽胞，可通过多种途径侵入机体，导致皮肤等感染，因此可采用主要抑制该葡萄球菌属的广谱消毒剂进行消毒。

3.3芽孢杆菌属分布情况

结果表明，芽孢杆菌属主要分布在内包室、内包材暂存室、混合室及制粒室中。芽孢杆菌具有代谢快、繁殖快的特点，且在无湿状态可耐低温和高温，细胞壁较厚，臭氧很难将其杀灭，表面消毒用的醇类消毒剂也对其无作用。研究显示，过氧乙酸和二氧化氯对蜡样芽孢杆菌具有杀菌速度快，使用浓度低以及易冲洗的优点，且杀菌效果优于过氧化氢

[2]，因此，可采用过氧乙酸或二氧化氯对环境及相关器具进行杀菌消毒。

3.4假单胞菌属、库克菌属分布情况

结果表明，假单胞菌属、库克菌属主要分布在充填室、内包室、混合室及洁净工艺走廊。假单胞菌属广泛存在于土壤、淡水、海水中，同时部分假单胞菌属可通过外分泌出的eDNA、脂类以及蛋白质等构成生物膜，这种结构不仅极大提高其对抗菌药物的抗性，更加强了其致病性，此外，假单胞菌属对干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，而且传统的氯制消毒剂对其杀菌效果不佳，因此，可选用过氧化氢杀菌剂对相关房间进行杀菌消毒。

3.5药品生产企业洁净车间污染源分析

  相关研究表明，制药企业洁净车间的污染源主要来源于人、空气、水、表面等四个方面[3]。革兰氏阳性球菌，如葡萄球菌、微球菌、库克菌，主要来自于实验室工作人员，可能与其皮肤脱落有关[1] [4]。本研究中葡萄球菌广泛存在整个车间，特别是更衣室及走廊人员密集的地方。芽孢杆菌主要来自于土壤，可能与人员、设备、物料的进入有关[1]。本研究中主要存在于设备表面及人员。革兰氏阴性杆菌如假单胞菌属，广泛存在水中，可能与整个车间水系统带入有关[5]。

参考文献

[1] SANDLE T． A review of cleanroom microflora: type,trends, and patterns [J]． PDA J Pharm Sci Technol, 2011,65(4): 392-403．

[2]莫金观，邓金花，黄静.不同消毒剂对蜡样芽孢杆菌的杀灭效果比较.中国消毒学杂志[J]，2008,25（6）：672-673

[3] PARK H K, HAN J H, JOUNG Y, et al． Bacterial persity in the indoor air of sterile pharmaceutical environment [J]．J Appl Micro, 2014, 116(3): 718-727．

[4] DAO H, LAKHANI P, POLICE A, et al． Microbial stability of sterile pharmaceutical and cosmetic products [J]． AAPS Pharm Sci Tech, 2018, 19(1): 60-78．

[5]刘亚茹, 余 萌, 肖 璜, 等．五家无菌制药企业洁净区微生物群落分析[J]．中国药事, 2019, 33(7): 586-590

[6] Sutton S，Jimenez L. A Review of Reported Recalls Involving Microbiological Control 2004-2011 With Emphasis on FDA Considerations of Objectionable Organisms[J]. American Pharmaceutical Review，2012，15（1）：42-57

[7]侯珂露, 黄 琳, 封宇飞．我国药品质量相关的药害事件的回顾性分析[J]．中国医院药学杂志, 2020, 40(6): 640-643

项目名称:制药企业生产洁净车间环境微生物群落检测与控制研究

项目编号：2020SZZ062