液质联用检测人体血浆中的奥司他韦和奥司他韦羧酸

刘云飞

1.摘要 采用HPLC法进行人体血浆中的奥司他韦及其活性代谢物奥司他韦羧酸浓度测定。方法:ACE Excel 5 C18 2.1*50mm色谱柱，水相：0.1% 甲酸水溶液，有机相：乙腈，流速0.4mL/min，柱温为35℃。实验用样品则需要进行甲醇提取进样，监测模式为MRM，进行内标法定量分析（奥司他韦-d3/奥司他韦羧酸 -d3为内标）。

结果：经验证的奥司他韦的线性定量范围为0.500 ng/mL~200 ng/mL，奥司他韦羧酸的线性定量范围为2.00 ng/mL~800 ng/mL。奥司他韦高、中、低 3 个浓度质控样品的平均提取回收率为95.13%、94.22%、91.89%，内标平均提取回收率为89.53%，奥司他韦羧酸高、中、低 3 个浓度质控样品的平均提取回收率为95.54%、95.87%、91.46%，内标平均提取回收率为88.83%，表明在本方法的定量范围内奥司他韦和奥司他韦羧酸具有足够、相对均一的提取回收率，且内标具有较高的回收率。

结论：本方法对于测定人血浆中奥司他韦和奥司他韦羧酸浓度的可靠性。

2.关键词奥司他韦和奥司他韦羧酸；流感；LC-MS /MS；血浆浓度

3.引言流行性感冒（以下简称流感）是流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，流感病毒属于正粘病毒科，为单股、负链、分节段 RNA 病毒。根据核蛋白和基质蛋白不同，分为甲、乙、丙、丁四型。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的 H1N1、H3N2 亚型及乙型流感病毒中的Victoria 和Yamagata 系。甲型和乙型流感病毒每年呈季节性流行，其中甲型流感病毒可引起全球大流行。全国流感监测结果显示，每年 10 月我国各地陆续进入流感冬春季流行季节。流感的治疗主要包括对症治疗以及抗病毒治疗，抗病毒药物主要包括神经氨酸酶抑制剂、血凝素抑制剂、M2 离子通道阻滞剂等。神经氨酸酶抑制剂对甲型、乙型流感均有效[1]。

磷酸奥司他韦是流感神经氨酸酶抑制剂，经水解转化为活性成分奥司他韦羧酸盐，抑制流感神经氨酸酶，从而阻断子代病毒颗粒的释放。该药适用于2周龄及以上的患者出现症状2天内的急性简单流感的治疗和1周岁以上人群的流感预防。推荐剂量为成人及青少年（13 岁以上）每次 75 mg，每日 2 次，持续 5 天。        磷酸奥司他韦是其活性代谢产物的药物前体，其活性代谢产物（奥司他韦羧酸盐）是强效的选择性的流感病毒神经氨酸酶抑制剂。神经氨酸酶是病毒表面的一种糖蛋白酶，其活性对新形成的病毒颗粒从被感染细胞中释放和感染性病毒在人体内进一步播散至关重要。同时也有报道指出神经氨酸酶对病毒进入未感染细胞也具有一定作用。

4.实验部分

4.1仪器和试药

岛津公司UPLC-30A 超高效液相系统，美国应用生物系统公司Triple Quad-5500三重四级杆质谱仪，配ESI（电喷雾离子源）。盐酸奥司他韦和奥司他韦羧酸标准品，来源：TLC Pharmaceutical Standards，批号：RS210604、4496-011A3；奥司他韦-d3/奥司他韦羧酸 -d3（内标），来源：TLC Pharmaceutical Standards，批号：2556-054A3、2556-098A10；乙腈（Merck），HPLC级；甲醇（Merck），HPLC级；甲酸（Dikma），HPLC级；超纯水（Millipore Milli-Q），实验室自制。血浆由湖南益阳康雅医院提供。

4.2分析条件

液相条件：色谱柱为ACE Excel 5 C18 2.1*50mm，柱温35℃，流动相0.1% 甲酸水溶液-乙腈，流速0.4mL/min，进样体积4μL。

质谱条件：ESI（电喷雾离子源），正离子检测，其中离子电压控制在5500V，去集簇电压70V，多反应检测（MRM）方式定量，奥司他韦313.2→225.1，奥司他韦羧酸285.2→138.1，奥司他韦-d3316.2→228.2，奥司他韦羧酸–d3288.3→138.1。

4.3溶液的配制

精密称取奥司他韦和奥司他韦羧酸对照品，用适量的甲醇溶解，使用校正因子，分别配制成浓度为1 mg/mL的奥司他韦和奥司他韦羧酸储备液。将奥司他韦和奥司他韦羧酸依次配制成 25.0/100、50.0/200、 150/600、800/3200、1600/6400、6000/24000、9000/36000和10000/40000ng/mL溶液。取奥司他韦-d3和奥司他韦-d3对照品，用适量的甲醇溶解，配制成浓度为 1.mg/mL 的内标储备液 IS-A ，用甲醇溶液稀释至200/1000ng/mL的内标工作溶液 IS‑C [1-5]。

2.4血浆样品处理

取血浆样品490 μL，加入奥司他韦和奥司他韦羧酸对照品系列溶液10μL，配制成相当于奥司他韦和奥司他韦羧酸血浆浓度为 0.500/2.00，1.00/4.00，3.00/12.0，16.0/64.0，32.0/128，120/480，180/720，200/800 ng/mL的血浆样品

，依次加入内标工作液IS‑C 10 μL（200 ng/mL），390 μL的甲醇溶液，涡旋5 min，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，使用移液工作站移取上清液100 μL至96孔板中，加入200 μL甲醇：水（1:9）溶液稀释，涡旋3分钟，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟后进行分析。

5方法与结果

蛋白沉淀法提取分析物和内标，采用反相色谱柱将奥司他韦和奥司他韦羧酸和内标从生物基质中分离，使用串联四级杆质谱仪的电喷雾离子化方式（ESI）对分析物进行定量分析。取空白血浆100 mL，按2.4“血浆样品处理”项下操作，通过分析物/内标的峰面积比值进行回归分析。奥司他韦和奥司他韦羧酸的标准曲线满足方法验证的线性要求，且标准样品满足方法验证的相关接受标准。奥司他韦标准样品的批间准确度偏差在-3.80% 和11.67% 之间，批间精密度在1.44% 和4.51% 之间；奥司他韦羧酸标准样品的批间准确度偏差在-4.50% 和11.67% 之间，批间精密度在1.90% 和3.95% 之间。

色谱图由 analystTM软件1.6.3版自动采集。用分析物和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到线性回归方程（使用加权最小二乘法，权重因子 1/x2），软件自动计算浓度。

经验证，1. 本专题考察了 6 个不同来源空白人血浆，分别配制了空白样品（不含分析物和内标的处理过的基质样品）、内标空白样品（含内标的处理过的基质样品）、定量下限；此外使用不同来源空白人血浆的混合基质配制内标空白样品和不含内标的奥司他韦/奥司他韦羧酸定量上限样品及混合空白基质加入单个待测物（不加其它待测物及内标）的定量上限样品。在6个不同来源空白人血浆样品中未检测到奥司他韦、奥司他韦羧酸或内标、内标空白样品中未检测到奥司他韦和奥司他韦羧酸、不含内标的奥司他韦/奥司他韦羧酸定量上限样品中未检测到内标，仅含待测物奥司他韦（不加待测物奥司他韦羧酸及内标）的定量上限样品未检测到奥司他韦羧酸及内标，仅含待测物奥司他韦羧酸（不加待测物奥司他韦及内标）的定量上限样品未检测到奥司他韦及内标。结果表明不同来源的基质对奥司他韦和奥司他韦羧酸的测定不存在干扰，且奥司他韦、奥司他韦羧酸以及内标之间也不存在相互干扰。本方法未见显著进样残留；

2.连续测定3天，考察3个分析批次，每批次各考察考察了奥司他韦和奥司他韦羧酸高、中、几何中、低 4 个浓度的质控样品，每个浓度 6 个样品。奥司他韦和奥司他韦羧酸高、中、几何中、低 4 个浓度质控样品批内准确度偏差在 -6.57% 到13.33% 之间，批内精密度在0.94% 到5.56% 之间，批间准确度偏差在 -3.88% 到8.67% 之间，批间精密度在2.97% 到4.08% 之间。

3. 奥司他韦高、中、低 3 个浓度质控样品的平均提取回收率为95.13%、94.22%、91.89%，内标平均提取回收率为89.53%，奥司他韦羧酸高、中、低 3 个浓度质控样品的平均提取回收率为95.54%、95.87%、91.46%，内标平均提取回收率为88.83%，表明在本方法的定量范围内奥司他韦和奥司他韦羧酸具有足够、相对均一的提取回收率，且内标具有较高的回收率。

4. 溶血效应、高脂效应考察了人血浆溶血现象在高、低浓度质控样品（每个浓度 4 个样品）中奥司他韦真实浓度的影响。提取后溶血样品、高脂样品的准确度的真实值在 ±15% 之内且精密度 %CV ≤15%，均满足相应的接受标准，表明人血浆溶血现象对奥司他韦血浆样品真实浓度无影响。溶血效应、高脂效应考察了人血浆溶血现象在高、低浓度质控样品（每个浓度 4 个样品）中奥司他韦羧酸真实浓度的影响。提取后溶血样品、高脂样品的准确度的真实值在 ±15% 之内且精密度 %CV ≤15%，均满足相应的接受标准，表明人血浆溶血现象对奥司他韦羧酸血浆样品真实浓度无影响[3]。

6小结

本方法中，盐酸奥司他韦和奥司他韦羧酸的标准样品和质控样品使用 K2-EDTA 为抗凝剂的人血浆配制，奥司他韦-d3和奥司他韦羧酸-d3 分别作为奥司他韦和奥司他韦羧酸的内标。采用蛋白沉淀法从 100 L 血浆中提取分析物和内标，采用反向色谱柱将奥司他韦和奥司他韦羧酸和内标从生物基质中分离，并使用串联四级杆质谱仪的电喷雾离子化方式（ESI）对分析物进行定量分析。经验证的奥司他韦的线性定量范围为0.500 ng/mL~200 ng/mL，奥司他韦羧酸的线性定量范围为2.00 ng/mL~800 ng/mL。

本研究对测定人血浆中奥司他韦和奥司他韦羧酸的 LC‑MS/MS 法进行了全面方法验证。方法验证结果证明了本方法对于测定人血浆中奥司他韦和奥司他韦羧酸浓度的可靠性。此方法的选择性、准确度、精密度、基质效应、耐用性、定量下限、溶血效应、高脂效应及全血稳定性均满足接受标准。

参考文献

[1].流行性感冒诊疗方案(2020 年版)[J].中国病毒病杂志,2021,11(01):1-5.DOI:10.16505/j.2095-0136.2020.0085

[2].磷酸奥司他韦胶囊说明书. 进口药品注册证号：H20140344；H20140828

[3]. 以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则,CFDA, 2016.

[4]普通口服固体制剂参比制剂选择和确定指导原则, CFDA, 2016.

[5]化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则, CFDA, 2005.

作者简介：刘云飞，1993.09，男，汉，安徽蚌埠，本科，助理工程师，目前从事生物样品检测工作。