mtDNA突变在脑胶质瘤辅助诊断中的临床价值

齐黎明1，张瑞剑2

[摘要]目的 评估线粒体突变作为新型分子标志物，在脑胶质瘤检测中外周血与肿瘤组织的一致性、敏感度和特异性。方法 收集内蒙古自治区人民医院神经外科2021年11月-2022年12月期间20例诊断为原发性脑胶质瘤患者。组织样本 20例，外周血样本各20例，采用 OPERA技术检测血浆中的mtDNA。整理检测结果，分析配对样本检测的准确性及一致性。结果 血浆mtDNA突变与组织学基因检测具有一致性，血浆mtDNA的检测有一定的灵敏度及特异度。结论 mtDNA某一区域突变，或许可以支持其作为诊断、预后和治疗反应标记物的使用，使其成为主要用于非侵入性方法（如液体活检）的有前景的生物标记物。

[关键词] mtDNA；脑胶质瘤；肿瘤；基因

胶质瘤起源于神经胶质干细胞或祖细胞，是中枢神经系统最常见的致死性原发性肿瘤，占所有脑原发性肿瘤的28%，并占所有脑恶性肿瘤的80%。WHO依其恶性程度将其分为Ⅰ~Ⅳ级[1] 。脑胶质瘤呈浸润性生长，肿瘤边缘境界不清，不易切除，且切除后易复发，给患者造成沉重的经济和心理负担［2]。高级别恶性胶 质瘤在成人原发性脑肿瘤中最常见，通过外科手术、放化疗等积极治疗，1 年和 5年生存率分别为30%和13%［3］。胶质母细胞瘤的侵袭程度最高，确诊后患者仅有15个月左右的的中位生存期，5年生存率为也仅为6.8%［4］。

线粒体是细胞进行有氧呼吸、钙信号传导、细胞代谢调节、血红素合成、类固醇合成以及细胞凋亡的关键场所[5]。在哺乳动物细胞中，线粒体可以通过氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)提供大部分能量[6]。mtDNA是长约16.5 kb的双链环状DNA,由编码区和非编码区组成[7]。编码区共编码包括22种转运RNA、13种多肽、2种核糖体RNA在内的37个基因；13种多肽包括复合体Ⅰ中的7种亚基(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6),复合体Ⅳ中的3种亚基(COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ),复合体Ⅴ中的2种亚基(ATP合成酶6和ATP合成酶8)和复合体Ⅲ中的细胞色素b(cytb)[8]。非编码区也称D-环区(D-loop),是mtDNA转录和复制的调控区域[9]。

传统意义上认为与nDNA相比，mtDNA由于分子量小、缺乏组蛋白的保护、长期暴露于ROS的环境中、缺乏有效的修复机制，因此mtDNA易受ROS的损伤而发生变异[10]。尽管如此，研究发现mtDNA仍具有高突变率，导致多种疾病的发生[11]。mtDNA在许多脑胶质瘤细胞中发生了改变。各种因素所致的mtDNA变化主要包括突变整合、基因沉默、基因表达的改变、mtDNA数量变化和不稳定性等, 这些与肿瘤的发生可能存在一定的关系[12]。

1材料与方法

1.1病例资料

1.1.1纳入标准

收集内蒙古自治区人民医院神经外科2021年11月-2022年12月期间20例诊断为原发性脑胶质瘤患者。包含年龄18-80岁经病理确诊的原发胶质瘤患者，包含1-4级，无心、肺、肝、肾等重要脏器功能障碍，术后无颅内感染出血等并发症，在入组前4周内未接受任何抗肿瘤治疗，可采集到足量的肿瘤组织、脑脊液和外周血样本进行检测，临床信息完善，签署知情同意。

1.1.2病例特征

本研究收集20例脑胶质瘤患者的脑脊液、新鲜肿瘤组织配对标本。其中男 性12例，女性8例，年龄33-64岁，平均年龄（48.5±15.5）岁。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类，胶质母细胞瘤（Ⅳ级）6例（30％），间变星形细胞瘤（Ⅲ 级）8例 （40％），间变少突细胞瘤 （Ⅲ 级 ）2例 （10％），星形细胞瘤（Ⅱ级）4例（20％）。

1.2方法

1.2.1研究方法

样本检测采用 OPERA技术检测血浆、脑脊液中的mtDNA。整理检测结果，分析配对样本检测的准确性及一致性。术中采用神经导航系统和功能定位检测技术，最大范围安全切除肿瘤组织。

1.2.2标本获取及mtDNA的提取

新鲜组织(>25mg，大于米粒大小，未坏死肿瘤组织比例大于70%)或石蜡切片标本(厚度为5-8um的10片白片)，清晨在患者空腹状态下，在肘静脉用EDTA抗凝管采集外周血约10ml，置于放有冰袋的冰盒中4℃保存并尽快送至实验室。采用Prelud E 基因组 DNA 提取试剂盒（吸附柱法）提取mtDNA。

1.2.4线粒体测序文库构建

采用OPERA Jupitor DNA通用建库试剂盒，针对普通的DNA片段化样本完成高性能的NGS检测，PRELUD E游离DNA提取试剂盒有效样本DNA，得到足量的测序文库，通过用二代测序（nextgenerationgsequencing，NSG）技术同时检测测序仪或qPCR检测文库分子，检测确定有效浓度，获得数据后进行生物信息学分析。

1.3生物信息学分析与统计学分析

以组织样本所检测出的线粒体突变类型为金标准，计算外周血样本中线粒体突变与组织基因突变的一致性。计算检测灵敏度和特异性。

用诊断试验的配对四格表进行资料统计，比较结果采用配对χ２ 检验（或McNemar检验），诊断方法的相关性采用普通四格表χ２ 检验及Fisher确切概率法直接计算概率；若有相关性则进一步计算列联系数。按α＝0.05的检验水准，Ｐ＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1血浆mtDNA与组织mtDNA检测关系

以组织样本所检测出的线粒体突变类型为金标准，采用SPSS19软件进行统计学分析。计量资料采用（±ｓ）描述。单个病人中，在组织中所检出的基因与所有检出基因完全一致则组织学阳性，在血浆mtDNA中所检出的基因与所有检出基因完全一致则为血浆mtDNA阳性，其中组织学阳性14例，血浆mtDNA阳性12例，见表１。

两组标本检出基因结果分析
计数
		肿瘤组织		合计
		阳性	阴性
配对血浆	阳性	11	1	12
	阴性	3	5	8
合计		14	6	20

标1

数据分析结果显示χ２ 值6.706，P=0.018＜0.05，可以认为两者的阳性检出率不同，McNemar检验Ｐ=0.625＞0.05，可以认为两者不具有差异性；kappa值为0.565，所以两者一致性中等，其中血浆mtDNA的灵敏度为78.6％，特异度为83.3％，一致率为80%，误诊率为16.7％，漏诊率为21.4％，Youden指数为0.619，阳性似然比为4.71，阴性似然比为0.26，阳性预测值为91.7％，阴性预测值为62.5％。

2.2基因分析

20例胶质瘤患者中共检测到基因突变132个，其中组织学标本共检出96个，血浆标本共检出36个，其中点突变（SNV）为最多，组织中发现88个占比91.7%，血浆中发现32个占比88.9%，其次是缺失插入（Inder），组织中发现8个占比8.3%，血浆中发现4个占比11.1%。组织线粒体突变频率（VAF）＞50%的数量是12占比12.5%，20%-50%的数量是10个占比10.4%，10%-20%的数量是18个占比18.8%，1%-10%的数量是56个占比58.3%。配对血浆线粒体突变频率（VAF）＞1%的数量是8个占比22.2%，0.1%-1%的数量是16个占比44.4%，0.02%-0.1%的数量是12个占比33.3%。

基因检测结果

基因突变类型		点突变（n=15）	缺失插入（n=8）
肿瘤组织mtDNA（n=20）	阳性	14	7
	阴性	6	13
配对血浆mtDNA（n=20）	阳性	12	5
	阴性	8	15
χ２ 值		0.44	1.026
Ｐ 值		0.507	0.311
灵敏度（％）		78.6%	57.1%
特异度（％）		83.3%	92.3%
一致率（％）		80%	80%
Kappa		0.565	0.529

表2

20例患者中点突变阳性患者15例，其中组织学阳性患者14例，配对血浆阳性患者12例，两者皆阳性患者11例，应用spss19软件进行统计学分析，样本量n＜40，用fisher精确检验P＜0.05，可以认为两者具有关联性，比较结果采用McNemar检验，P＞0.05，可以认为两者不具有差异性，kappa值0.565可以认为两者的阳性检出率具有一致性。其次20例患者中缺失插入阳性患者8例，其中组织学阳性患者7例，配对血浆阳性患者5例。样本量n＜40，用fisher精确检验P＜0.05，可以认为两者具有关联性，比较结果采用McNemar检验，P＞0.05，可以认为两者不具有差异性，kappa值0.529可以认为两者的阳性检出率具有一致性，见表2。

3讨论

本研究的基因检测显示，血浆mtDNA突变与组织学基因检测具有一致性，血浆mtDNA的检测有一定的灵敏度及特异度，与组织标本相比一致率55％，血浆对比脑部肿瘤组织而言，相对容易获取，可重复获取，病人接受度较高，血浆mtDNA的检测可以为脑胶质瘤液体活检作补充，有一定的参考价值。另外本研究通过对mtDNA的基因突变检测，可以为脑胶质瘤患者的预后及精准治疗提供重要的生物信息[13]。针对肿瘤细胞而言，迄今为止在许多不同的肿瘤中发现有明确的线粒体DNA突变，并且和正常细胞不同的是，这些细胞内的线粒体突变表现为“同质性”，即同种细胞内的线粒体DNA都发生相同的突变[14]。

mtDNA某一区域突变，或许可以支持其作为诊断、预后和治疗反应标记物的使用，使其成为主要用于非侵入性方法（如液体活检）的有前景的生物标记物。尽管这项研究具有潜力，但使用这种生物标志物筛查和/或诊断胶质瘤仍然有限，因此需要进一步的研究[15]。

［参 考 文 献］

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