鱼油中多不饱和脂肪酸的位置分布检测方法

虞哲宇

摘要：(n-3Polyunsaturatedfattyacid,n-3PUFA),尤其是二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid,DHA),在防治心血管疾病，抑制癌症，抗炎，促进婴幼儿大脑以及视觉系统发育等方面发挥重要作用，因此广泛应用于食品和医药行业。在以往的研究中，主要侧重提高鱼油中EPA和DHA的纯度。然而，鱼油中含有的色素、氧化产物、皂类以及微量金属元素等杂质会降低鱼油品质，进而影响后续富集纯化和生理活性试验。据报道，油脂在脱色过程中不仅能迅速脱去色素，而且脱色剂对油脂中其它杂质也有一定的吸附作用。

关键词：鱼油；加工工艺；sn-2位脂肪酸；核磁共振碳谱；二十二碳六烯酸

引言

高脂血症是指体内脂类代谢紊乱导致血脂水平增高的一种病症。其与心肌梗死、中风、脂肪肝、糖尿病等疾病的发生关系密切，是引发脑梗死的主要潜在因素，是引起动脉粥样硬化和冠心病发生的重要危险因素之一，同时还会引起糖尿病等疾病。高脂血症具体表现为脂肪代谢或转运异常，血清中总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量过高，而高密度脂蛋白（HDL）含量降低。研究表明膳食脂肪酸与高脂血症的发生关系密切，多不饱和脂肪酸具有明显的降血脂作用。二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）是重要的多不饱和脂肪酸，是人体和动物不能合成，由食物提供的一类必需脂肪酸。鱼油中富含EPA、DHA等ω-3多不饱和脂肪酸，具有降低血液中TC、TG、LDL-C，升高HDL-C等重要作用，还可以改善血液微循环，降低血液黏稠度，在一定程度上极大地缓解和治疗高脂血症

1实验方法

1.1 Sn-2-MAG的制备

鱼油（市售）；浓硫酸、无水乙醇等（均为国产分析纯）。鱼油软胶囊（山东禹王制药有限公司），成分含量为DHA30~45g/100g、EPA25~40g/100g。产品规格：0.35g/粒。食用方法：每日3次，每次3粒。

该方法根据JointJOCS/AOCS官方方法Ch3a-19进行了略微改进。将30mg油、300mg无水乙醇和4wt%Novozym435混合均匀放置在玻璃反应器中，然后以400r/min的转速在30℃的集热式恒温磁力搅拌器中恒温水浴反应3小时后，将反应混合物转移到2mL离心管中。以10000r/min的转速离心3分钟去除脂肪酶，将有机相用氮吹仪浓缩至干。将残留物用100μL正己烷溶解上样至硅胶板，以正己烷/乙醚/乙酸（50:50:1，v/v/v）为展开剂进行分离。在碘缸中放置3min，识别并刮取sn-2-MAG条带，然后用无水乙醚多次萃取，甲酯化后用气相色谱分析。

1.2仪器与设备

KDL-1型分子蒸馏设备,德国UIC公司;TRP-12型直联高速旋片式真空泵,北京北仪优成真空技术有限公司;DCP3000型数显真空表,德国Vacuubrand公司;VSP3000型真空探头,德国Vacuubrand公司;Laborota4000型旋转蒸发仪,德国Heidolph公司;6890N型气相色谱仪,美国Agilent公司.

1.3脂肪酸组成分析

使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)系统对不同部位高白鲑鱼油进行分析。气相色谱-质谱联用仪使用安捷伦HP-5-MS毛细管柱。进样器和检测器的温度分别设置为250和300℃。程序设置:50℃下保持1min,以20℃/min升至170℃,以4℃/min升至250℃并保持3min,以20℃/min增加至280℃。在分流模式(1∶50)下样品进样量为1μL,载气为1mL/min恒定体积流量的氮气。脂肪酸组成的测定通过比较相对保留时间和NIST02质谱数据库。

1.4脂肪酸测定

前处理：称取均匀试样0.1g左右，加入2.0mL十一碳酸甘油三酯内标溶液。加入2%氢氧化钠甲醇溶液8mL，回流至油滴消失，加入7mL15%三氟化硼甲醇溶液继续回流2min，停止加热，加入10mL正庚烷，振摇2min，加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正庚烷提取溶液约5mL，加入约3～5g无水硫酸钠，振摇1min，静置5min，吸取上层溶液待测。1.3.6挥发性成分GC-MS测定样品气体收集：称样品2g置于装有磁力搅拌子的萃取瓶中，60℃恒温水浴加热，平衡5min，萃取30min，解析5min后进样。

2结果与讨论

2.1总脂肪酸组成

如表1所示，所有鱼油样品中检测到的PUFA主要为DHA和EPA，含量占比分别为9.64%-76.63%和6.36%-56.37%。此外鱼油中还有含量比较高的18:1n-9，为0.55%-24.94%，以及16:0，为0.54%-20.10%。所有海洋鱼油中总n-6PUFA含量较低，仅有0.29%-10.62%，而总n-3PUFA含量较高，达到了20.18%-90.17%。膳食中适当补充n-3和n-6系列脂肪酸将有助于人体的健康，据报道n-3PUFA摄入不足会增加心血管疾病的风险。天然鱼油中DHA和EPA分别占9.64%-25.95%和8.34%-21.80%。与其他天然鱼油相比，金枪鱼油中DHA含量显著最高（P<0.05）。

表1气相色谱检测不同鱼油中总脂肪酸的含量

2.2单级分子蒸馏富集乙酯型鱼油中EPA和DHA

在刮膜转速120r/min、蒸馏压力0.1Pa、冷凝温度(20±1)℃的条件下,将EPA和DHA质量分数分别为25.17%和15.34%的乙酯型鱼油(低含量乙酯型鱼油,下同)在不同的蒸馏温度下进行单级分子蒸馏,分别收集轻、重相组分测定其EPA和DHA质量分数,.当蒸馏温度为70℃和80℃时,轻相组分中只检测出少量EPA乙酯(而不存在DHA乙酯),随蒸馏温度的提高,EPA乙酯和DHA乙酯的平均分子自由程不断增加,轻相组分中EPA和DHA的质量分数不断提高.与此同时,重相组分中的EPA质量分数却呈现先缓慢提高后又逐渐降低的趋势,这与林文等观察到的现象一致.但由于重相组分中DHA质量分数的不断增加,最终使得EPA和DHA的总质量分数由46.06%(70℃)提高到74.40%(120℃)。

2.3单因素实验结果

在脱色温度80°C，固体吸附剂添加量2%，脱色时间8min条件下，分别考察活性炭、硅藻土、凹凸棒、活性白土、脱色砂对鱼油脱色的效果。5种固体吸附剂对鱼油均有脱色效果，其中硅藻土的脱色能力最弱，鱼油的脱色率仅1.38%。脱色砂和凹凸棒对鱼油虽有一定的脱色作用，但脱色能力明显不足，对鱼油的脱色率分别为8.79%和36.23%。活性炭和活性白土是油脂工业中广泛应用的脱色剂，对油脂中色素的脱除效果显著。活性炭和活性白土对鱼油的脱色率均超过60%，并且活性白土脱色效果更胜一筹，其脱色率在84%以上。研究表明，活性白土对叶绿素、类胡萝卜素及其衍生物有很强的吸附性，而活性炭易于吸附蓝、绿色素。此外，活性炭颗粒较小，脱色离心后难与鱼油实现有效分离，故选择活性白土为固体吸附剂。

2.4添加鱼油对蛋鸡血清脂质代谢的影响

鱼油经日粮被机体摄入后，能够增加血清中的LDL颗粒直径，使LDL核心胆固醇酯的不饱和度及其流动性增加，从而导致胆固醇从体内排泄加快，进而降低了血清中TC含量；也可通过减少肝脏中胆固醇合成的关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCoA还原酶），降低机体中TC合成。鱼油降低TG含量的机制可能是鱼油富含n-3PUFA，可抑制肝脏中脂肪酸和TG的合成；抑制肝脏极低密度脂蛋白（VLDL）的合成和分泌，促进周围组织和肝脏中VLDL残体的清除；抑制VLDL中载脂蛋白B的合成。研究表明，蛋鸡采食富含ω-3PUFA的日粮，能够明显改变蛋鸡血清中脂类物质含量，降低血清TC、TG和LDL-C含量，提高HDL-C含量。在蛋鸡基础日粮中添加不同比例的双低菜油、鱼油、亚麻油（0、1%、2%），血清中TC、LDL-C含量随着鱼油添加量的增加有所下降，而HDL-C含量上升，与本试验研究结果一致。本试验中，添加鱼油能够明显改变蛋鸡血清中脂类物质的组成，降低血清TC、TG和LDL-C含量，提高HDL-C含量，与前人研究结果一致。本试验中，与对照组相比，添加鱼油的各试验组高密度脂蛋白胆固醇含量均有所提高，其中Ⅴ组、Ⅵ两组鸡蛋的总胆固醇降低幅度和高密度脂蛋白胆固醇的增加幅度均比其余试验组快，原因是鱼油中含有大量的DHA和EPA，HDL合成酶即卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）和脂蛋白脂酶（LPL）活性会因EPA和DHA而提高，降解酶即肝内皮细胞酶（HEL）活性则会因EPA和DHA降低，从而导致血清HDL-C水平升高，导致组织中胆固醇的合成减少，促进蛋鸡体内胆固醇的排出。

3结论

鱼油脂肪酸的组成以及其在TAG上的位置分布是决定其营养功能和生物利用度的关键因素。加工鱼油相较于天然鱼油拥有更高的DHA和EPA含量。但是加工鱼油中DHA在TAG上是均匀分布的，而在天然鱼油中DHA主要分布在sn-2位。EPA的位置分布无明显规律，无论鱼油是天然的还是加工的，它都可以主要分布在sn-1,3，sn-2位置，或者随机分布。不同天然鱼油中SFA如14:0、16:0、18:0等和MUFA如16:1、18:1、20:1等也没有明确分布规律。鱼油的加工工艺可以提高DHA的含量但是改变了其DHA在甘油三酯碳骨架的分布。该研究不仅为分析含有高PUFA的油脂TAG结构分析提供了新方法，而且也为母乳替代脂或者其他结构酯的合成提供了原理依据。不同DHA分布方式的鱼油的生物利用度的差异是接下来的研究重点。

结束语

对于较低n-3PUFA含量的鱼油,分子蒸馏技术可显著提高其EPA和DHA质量分数,而对于较高n-3PUFA含量的鱼油,分子蒸馏则可用于调节其EPA/DHA值,且其EPA/DHA值与蒸馏温度具有较好的线性关系.对于分子蒸馏所得较高n-3PUFA含量的鱼油,尿素包合技术可较显著地进一步提高其EPA和DHA质量分数,但对鱼油EPA/DHA值的影响较小.通过联合使用分子蒸馏与尿素包合技术,可制备得到一系列具有不同EPA/DHA值的高质量分数甘油酯型鱼油,为进一步深入研究不同EPA和DHA质量分数比例鱼油的生理功能差异奠定基础。

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