基于网络药理学探讨丹参治疗年龄相关性黄斑变性的作用机制

姜菲1 ,吴丽娜2 ,杜红艳3

2 内蒙古医科大学 内蒙古呼和浩特市 010107

3内蒙古自治区人民医院 内蒙古呼和浩特市 010017，邮箱：[e-mail]

摘要：

目的: 通过网络药理学和生物信息学方法探讨中药丹参治疗年龄相关性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)的作用机制。

方法: 借助中药系统药理学数据库与分析平台( TCMSP) 获取中药丹参的有效成分与作用靶点，使用 Uniport 数据库进行基因 ID 的注释，在 GeneCards、OMIM 数据库中查找 AMD 的相关基因。使用Cytoscape3.9.1将药物-关键有效成分-疾病靶点网络可视化，在String数据库平台构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI) 网络，再利用 DAVID数据库进行基因本体(GO) 富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG) 通路富集分析。

结果: 通过筛选得到丹参有效成分65个，与AMD相关的关键有效成分36个，丹参与 AMD 的共同基因靶点163个;GO 功能富集得到964个条目，生物学过程主要涉及对化学刺激的反应、生物质量的调节、对含氧化合物的反应、蛋白激酶活性和磷酸转移酶活性等生物途径。KEGG 富集分析后得到164条信号通路，与糖尿病并发症中的 E-RAGE 信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路等等机制相关。

结论: 丹参治疗AMD 具有多成分、多靶点、多通路的特点，为进一步研究AMD 的治疗提供了思路。

关键词：网络药理学、丹参、年龄相关性黄斑变性、富集分析

引言：

年龄相关性黄斑变性(AMD) 是一种难治性眼底病变，以年龄为主要危险因素。临床根据有无脉络膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV) 分为干性与湿性两型，分别以眼底黄斑部玻璃膜疣、地图样萎缩及视网膜色素上皮脱离、黄斑部出血水肿为主要特征表现，是全球第三大致盲因素[1-3]。目前西医治疗AMD 的方法较多，包括抗血管内皮生长因子玻璃体腔内注射、光动力疗法、激光及手术等，但均为针对 CNV 的治疗手段，对以地图样萎缩为主要表现的干性 AMD尚无有效疗法，且存在治疗频率高、对药物的延迟应答或不应答等不足[3-5]。近年来，中医药在 AMD 的治疗中彰显了明显的优势，AMD 在中医属“视瞻昏渺”“视直如曲”及“暴盲”的范畴，病位在肾、脾、肝，针对其本虚标实的病机，以扶正祛邪为治则，往往能取得较好的疗效，可改善患者视功能、延缓疾病进展[6]。

丹参为唇形科草本植物丹参干燥的根和根茎，味苦，微寒，具有活血化瘀，凉血清心，除烦安神的功效。主要化学成分包括丹参酮类、丹参酸类、无机元素等，具有抗氧化，抗炎、降糖等药理作用，因此临床常将丹参配伍其他药物用于AMD的治疗[6]。网络药理学是一门以系统生物学、生物信息学和高通量组织学为基础，集药理学和信息网络为一体的综合学科，对预测中药多成分、多靶点、多途径的作用机制有重要意义，在探索药物对疾病的基本作用与机制、分析中医理论及研究中药的应用等方面广泛运用[7]。

因此，本研究采用网络药理学联合生物信息学的研究方法，分析中药丹参治疗AMD 的有效成分、作用靶点及参与的生物途径，探讨其可能的疗效机制，以期为今后进一步的实验探索提供理论依据。

1材料与方法：

1.1 药物主要有效成分及作用靶点的获取 ：

借助中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) 获得药物的主要有效成分和作用靶点。在其中搜索关键词“丹参”，并将检索条件设置为口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18，进一步筛选其主要有效成分和作用靶点。在 Uniport 数据库中对药物作用靶点进行标准化处理，转化为对应基因。

1.2 药物-疾病核心靶点的获取：

与AMD 疾病相关的基因靶点从在线数据库人类基因信息数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/) 中检索获取。以“age-related macular degeneration”为关键词分别从中检索相关基因，删除重复后合并。将丹参的药物靶点基因与 AMD 的疾病相关基因取交集，所得交集基因即为丹参治疗AMD的核心基因，并对所得结果在线绘制韦恩图。

1.3 药物-关键有效成分-疾病靶点网络可视化

丹参及其关键有效成分与 AMD 靶点之间作用网络的可视化借助 Cytoscape 3.9.1软件实现。通过药物与疾病的交集基因再次筛选药物有效成分后，可获得丹参治疗AMD的关键有效成分，将核心基因与关键有效成分同时导入软件，完成可视化处理。

1.4 生物信息富集分析

药物-疾病核心基因的生物信息富集分析通过在线基因注释工具 DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/) 实现。包括在基因本体( Gene Ontology，GO) 生物信息( 包括生物过程、细胞组分、分子功能) 富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 信号通路的富集分析等，了解丹参干预AMD 主要参与的生物通路，探讨其作用机制。

2结果:

2.1丹参有效成分筛选及靶点预测：

在 TCMSP 数据库中共检索到丹参有效成分202个。按照同时满足 OB≥30% 和DL≥0.18 的条件筛选后最终得到丹参的有效成分65个。采用PubChem数据库绘出以上所找化合物的化学结构，并对化合物生成的Canonical SMILES号进行保存。将Canonical SMILES号输入到Swiss Target Prediction数据库（筛选条件：probablity＞0.1）进行化合物的靶标预测。

2.2药物-疾病核心基因的获取：

在 TCMSP 数据库中检索丹参主要有效成分的作用靶点，去除重复及无意义的作用靶点后，使用Uniport 数据库进行基因 ID 的注释，共获得498个药物作用靶点。在 GeneCards数据库中检索AMD疾病相关基因，筛除重复项后获得 2140个相关基因，将丹参与AMD的靶点基因进行映射，得到163个药物与疾病的共同基因靶点（图1A）。

2.3药物-关键化学成分-疾病网络的构建

将163个共同靶点基因与药物的65个有效成分进行匹配，再次筛选得到36个丹参治疗AMD的关键有效成分，再将163个共同靶点基因和36个关键有效成分均导入Cytoscape软件进行可视化处理。其中内圈椭圆形为药物关键化学成分，外圈三角形为作用于疾病的基因靶点。而颜色由黄到红，色越深接近于红代表作用越密切。通过筛选条件：自由度（Degree:10-41），得到核心靶点网络（图1B）。

2.4生物信息富集分析

对筛选出来的163个核心基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO 功能富集分析筛选条件为：FDR＜0.0001，Count≥20，-log10(p value)≥10。筛选后得到964个条目，其中生物过程条目( Biological Process，BP) 721 个，主要涉及细胞对化学刺激的反应、生物质量的调节、对含氧化合物的反应和细胞对有机物的反应等（图1C）。细胞组分条目( Cellular Component，CC) 84个，基因产物主要位于内膜系统、囊泡、质膜部分和膜筏等位置（图1D）。分子功能( Molecular Function，MF)159个，主要与催化活性、酶的结合、信号受体结合、药物结合、蛋白激酶活性和磷酸转移酶活性等方面相关（图1E）。

KEGG 富集分析后得到164条信号通路，根据筛选条件：FDR＜0.0001，Count≥20，-log10(p value)≥10，选取了主要的信号通路。主要与糖尿病并发症中的 E-RAGE 信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路等机制相关（图1F）。

图1：丹参治疗AMD网络药理学结果图

3讨论与结论：

中医学中没有“黄斑变性”这一病名，因其“外不见症，从内弊之”而被归于内障眼病范畴，《证治准绳·七窍门》中有相关症状描写: “目内外别无证候，但自视昏渺，蒙昧不清也”“视直物如曲，弓弦、界尺之类视之皆如钩。”中医从整体观出发，认为AMD 的发生原因“有神劳、有血少、有元气弱、有元精亏而昏渺”，根本病机在于精、气、血的亏损，主要责之肾、脾、肝，是一个本虚标实的病理过程，治疗应以益气养血、扶正祛邪为原则。丹参为唇形科草本植物丹参（Radix Salviae）干燥的根和根茎，味苦，微寒，具有活血化瘀，凉血清心，除烦安神的功效。主要化学成分包括丹参酮类、丹参酸类、无机元素等，具有抗氧化，抗炎、降糖等药理作用。因此临床常将丹参配伍其他药物用于AMD的治疗。丹参在虚证的治疗中具有重要的意义，也是 AMD 临床组方的高频用药。

本研究筛选出丹参治疗 AMD 的34个关键有效成分，包括丹参酮Ⅵ、丹参酮IIA、丹参醛、柳杉酚、硬尾醇、鼠尾草酚酮、沙维酮、丹酚酸j、紫丹参素c、普氏野牛皮、多孔甾醇、新隐丹参酮II、新隐丹参酮、次丹参醌、米替波隆、微甜菊醇、次甲丹参醌、泪杉醇、毛地黄黄酮、异丹参酮II、异欧前胡素、表丹参螺内酯、二氢丹参酮Ⅰ、地高辛、去羟新隐丹参酮、脱氢丹参酮II a、丹参新醇B、丹参新醇A、隐丹参酮、铁锈醇、贝加灵、4-亚甲基丹参新酮、2 -异丙基-8甲基菲- 3，4 -二酮、1，2，5，6 -四氢丹参酮、poriferast-5-en-3beta-ol、NSC 122421等。现代研究发现，以上有效成分，可分别通过对抗氧化应激或抑制新生血管生成等机制发挥对AMD的潜在治疗作用。

GO 功能与 KEGG 信号通路富集结果显示了丹参可能参与AMD的生物过程。GO 富集结果显示主要涉及对化学刺激的反应、生物质量的调节、对含氧化合物的反应、蛋白激酶活性和磷酸转移酶活性等生物途径。KEGG 富集结果显示，治疗过程中可能涉及的信号通路包括与糖尿病并发症中的 E-RAGE 信号通路、TNF信号通路[8]和HIF-1信号通路[2]等。

综上所述，本研究通过网络药理学与生物信息学方法，分析了中药经典药丹参参与 AMD 治疗多成分、多靶点、多通路的可能作用机制，为丹参治疗 AMD 提供了理论依据，也为更深入的实验研究奠定了基础。

4参考文献：

[1]Mao K, Shu W, Qiu Q, et al. Salvianolic acid A protects retinal pigment epithelium from OX-LDL-induced inflammation in an age-related macular degeneration model [J]. Discov Med, 2017, 23(125): 129-147.

[2]Liang IC, Ko WC, Hsu YJ, et al. The Anti-Inflammatory Effect of Hydrogen Gas Inhalation and Its Influence on Laser-Induced Choroidal Neovascularization in a Mouse Model of Neovascular Age-Related Macular Degeneration [J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(21).

[3]Nair AA, Finn AP, Sternberg P, Jr. Spotlight on Faricimab in the Treatment of Wet Age-Related Macular Degeneration: Design, Development and Place in Therapy [J]. Drug Des Devel Ther, 2022, 16: 3395-3400.

[4]Rafael D, Guerrero M, Marican A, et al. Delivery Systems in Ocular Retinopathies: The Promising Future of Intravitreal Hydrogels as Sustained-Release Scaffolds [J]. Pharmaceutics, 2023, 15(5).

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[6]Cao Y, Li XY, Tchivelekete GM, et al. Bioinformatical and Biochemical Analyses on the Protective Role of Traditional Chinese Medicine against Age-Related Macular Degeneration [J]. Curr Eye Res, 2022, 47(10): 1450-1462.

[7]Yang Y, Wang Y, Liu X, et al. Network Pharmacology-Based Identification of Key Targets of Ziyin Mingmu Pills Acting on Age-Related Macular Degeneration [J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2023, 2023: 5933125.

[8]Chernykh V, Shevchenko A, Konenkov V, et al. TNF-α gene polymorphisms: association with age-related macular degeneration in Russian population [J]. Int J Ophthalmol, 2019, 12(1): 25-29.