粪大肠菌群检测的结果偏差及影响因素

王昕

摘  要：介绍了目前城镇污水处理消毒后的出水中粪大肠菌群指标的检测方法原理，对检测结果偏差产生的原因进行了分析和阐述，提出了检测过程中的质量保证措施，对基层实验室提高粪大肠菌群检测结果的精确性具有实际指导意义。

关键词：粪大肠菌群；质控；影响因素；偏差

目前，粪大肠菌群的检测作为城镇污水处理厂排放标准的重要指标之一，经常被环保督查部门抽检。而各厂在进行日常出水检测时，也存在着实验室内及实验室间实验结果差异性较大的问题。由于微生物检测技术、方法、水样等的特殊性，导致影响其检测数值偏差大的因素较多，本文结合实际检测工作，从实验方法、培养基的质量控制、检测环境条件及现场采样等多方面进行分析，阐述这些因素的影响及质控措施。

目前，污水类的粪大肠菌群的检测，常采用多管发酵法、滤膜法和酶底物法。三种方法的生物学培养机理是相同的，由于使用的培养基成分、培养介质和菌落形成的特征和方式的不同，最终导致了粪大肠菌群检测结果的差异，这是由于检测方法导致的偏差。下面简单介绍一下这三种常用方法：

1  常用粪大肠菌群的检测方法

1.1  多管发酵法

多管发酵法是以最可能数来表示试验结果的。实际上它是根据统计学理论估计水体中大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阴性又显示阳性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目，要根据所要求数据的准确度而定。

多管发酵法是先在37度下培养，产酸产气则为阳性，也就是总大肠菌群。然后再进行复发酵，从37℃培养出来的总大肠菌群，再接种到EC培养基中，45℃下产酸产气的则为粪大肠菌群。

1.2  滤膜法

滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已被灭菌的放有滤膜（孔径0.45μm）的抽滤器中， 经过抽滤，细菌即被截留在膜片上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，在44.5℃温度下恒温培养，对微生物细胞染色后，对滤膜上生长的此特性菌落进行计数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群的个数。

1.3  固定底物技术酶底物法（DST方法）

固定底物技术酶底物法采用大肠菌群细菌能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG使培养液呈黄色，以及大肠埃希氏菌产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群。

酶底物法相比较滤膜法和多管发酵法的假阳性和假阴性发生率更低。能够精确检出100ml水样中单个的活性粪大肠菌群，假阴性更低。且试剂对异养细菌的抑制率更高，假阳性率低。能够消除传统方法中的主观判断影响，准确性高于滤膜法及多管发酵法。

从三种方法的检测原理和方法来看，存在结果的偏差是客观存在的，而且粪大肠菌群的检测本来也是基于统计学概率基础之上的，因此，方法的选择对其最终的检测数值有一定的影响。一般来说，测试结果在一个数量级之内，是可承受的偏差范围。

当然，对于微生物检测结果准确性的影响因素还很多，以下这些方面如果不严格控制，也会导致检测数据的较大偏离。这也是实验过程中应当关注的问题和质量保证措施的一部分。

2  引起检测结果偏差的因素

2.1  检测环境因素

在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很容易造成污染，对培养工作干扰很大。因此，微生物实验室应保持清洁，以防污染。在微生物实验进行的前后，应对无菌室及超净台紫外灯辐照灭菌30分钟以上。标准检验方法规定，应定期对紫外灯进行维护保养，且对其空气消毒效果进行测定。实验室内部实验装置也应按要求灭菌。

2.2  培养基的质量

微生物的生长需要营养物质，培养基则是供微生物生长繁殖的人工配制养料。所以其品质的优劣，保存是否得当，配制使用是否正确等，都对微生物培养结果产生很大影响。一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。如果培养基发生结块、颜色异常，或发生其他变质迹象，就不能再使用了。超过保质期的培养基尽量不要使用。

2.3  微生物样品管理

2.3.1采样瓶的洗涤：一般可用加入洗涤剂的热水洗刷采样瓶，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1至2次。新的采样瓶必须彻底清洗，先用水和洗涤剂清洁尘埃和包装物质，后用铬酸和硫酸洗涤液清洗，再用稀硝酸溶液冲洗，以除去任何一重金属或铬酸盐的残留物，最后先用自来水，再用蒸馏水冲洗干净。

2.3.2采样瓶的灭菌：将洗涤干净的采样瓶瓶盖虚掩，放入高压灭菌锅中，于121℃～124℃下经30min高温灭菌。

2.3.3样品采集

    已灭菌的采样瓶，在采样时应小心打开瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染。采样时不需要用水样冲洗采样瓶，应直接采样分装。

2.3.4样品的保存

地表水、污水和废水的水样很容易受到物理、化学或生物的作用而变质，因此，采集好的水样应迅速运往实验室进行分析。一般从取样到检验，其时间间隔不宜超过2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。实验室接到送检样后，应将样品立即放入冰箱，并在2h内安排检测。

2.4 实验中的其他影响因素

2.4.1 由于微生物样品的特殊性，其在水中的分布不均匀，所以在做样前应充分振荡摇匀，使其分布均匀后再取样，以减少偏差。

2.4.2 使用滤膜法做样时，对滤器及抽滤头酒精高温消毒时，应充分燃烧，使75%酒精挥发完全，否则会影响检测结果。

2.4.3使用滤膜法做样时，培养基倒入过多则因液体流动，菌群就会沿其流动走向乱长，最终影响检测值得准确性。倒入过少则养分不够，菌群生长不完全，数值会偏小。所以，培养基的倒入量应使吸收垫吸收饱满后刚好多一滴水珠大小的量即可。

3  结语

综上所述，导致微生物检测结果偏差的影响因素较多，在获得检测结果时，我们除了要了解采用的是哪种检测方法外，更重要的是分析整个检测过程操作的规范性，保证质量控制有效。但同时，再了解了试验方法的选择性和差异性后，即使同一方法下，存在检测结果的偏差也是允许的，这是微生物检测结果统计的概率性所决定的。

参考文献

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