舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷含量的测定

胡爱娣[1] 王晴丹 梁敏

摘要：目的 建立舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷的含量检测方法。方法 取本品研细过五号筛，称取0.3 g，放入锥形瓶，用25 ml移液管移取25 mL50%甲醇，摇晃均匀，超声处理30 min，用HPLC法测定。结果 柚皮苷和新橙皮苷分别在1.90152～47.7288 μg/mL、2.91232～54.8080 μg/mL的范围内线性良好，线性方程分别为y＝15814x+2776.8（r=0.99975）、y＝19514.9x+91.0（r=0.99997）；平均加样回收率分别为100.6 %（RSD=1.5 %，n=6）、100.2%（RSD=1.0 %，n=6）。结论 本方法提取过程简单，操作省时省力，稳定性、重复性、专属性优，适用于舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷的测定。

关键词：舒肝片；枳壳；柚皮苷；新橙皮苷

Determination of Hesperidin and neohesperidin in Shugan tablets 

Hu Ai-di    Wang Qing-dan   Liang Min

(Zhanjiang Institute for Food and Drug Control，Guangdong  Zhanjiang524000)

Abstract: Aim  To build a approach for determining the contents of naringin and neohesperidin in Shugan tablets simultaneously. Methods  Performed on Agilent Eclipse XDB-C18 column(4.6×250 mm，5μm), the analysis of 50%methanol extract from Shugan tablets was kept at 40 ℃, with acetonitrile and 0.1%phosphoric acid (19:71) flowing at 1.0 ml/min and the detection wavelength set at 283 nm. Results  Both naringin and neohesperidin had good linear relationships within the ranges of 1.90152～47.7288 μg/mL and 2.91232～54.8080 μg/mL( r﹥0.9995), respectively; average recoveries were 100.6% and 100.2% with the RSDs of 1.53 % and 0.95%(n=6)，severally. Conclusion  The method is simple, actionable, repeatable, and accurate for the measurement of naringin and neohesperidin in Shugan tabletswhich , which can be help for the quality detection system of  Shugan tablets.

Key words：Shugan tablets；Aurantii Fructus；hesperidin；neohesperidin

舒肝片[1]是由枳壳、川楝子、陈皮、片姜黄等12味中药经过特定工序加工处理后，加入淀粉与硬脂酸镁制成的素片，可以消食化积，舒气开胃，止痛除烦，临床上[2-4]用来治疗肝郁气滞、肝胃不和、功能性消化不良、慢性胃炎等。枳壳枳壳在方中用量大，为方中君药，是舒肝片的重要组成部分。枳壳[5]为芸香科植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实，味苦、辛、酸、性温，归脾胃经，具有消积散痞，行气宽中除胀的功效，主要用于气实壅满所致的积滞内停，痞满胀痛，胸胁气滞，涨满疼痛，食积不化等。枳壳中的黄酮类成分药理活性较强,是主要药效物质基础之一,是枳壳理气宽中、行滞化痰的重要成分[5-7]。柚皮苷和新橙皮苷是枳壳中含量最多的黄酮类成分[5]。故选择这两个成分作为舒肝片中枳壳的控制指标。而关于舒肝片中枳壳的报道出现在张丽芳[8]《舒肝片的制剂工艺改进和质量标准提高》中，但文章中仅采用单一因素控制枳壳质量，即仅对枳壳中柚皮苷进行了含量测定的研究，更重要的是这只是针对工艺流程改进后的舒肝片，并非对原工艺流程的舒肝片进行的探索。为了更好控制市面上舒肝片质量, 保证临床用药安全有效，选择双因素控制枳壳的质量，即采用HPLC，对舒肝片中枳壳的主要成分新橙皮苷和柚皮苷，进行检测。

1 仪器与试剂

1.1仪器 超声清洗器SK8200HP（功率500 W，频率53 KHz，上海科导超声仪器有限公司）；隔膜真空泵GM-0.33B（天津市津腾实验设备有限公司）；万分之一天平AB204-N、十万分之一天平AG135（梅特勒-托利多公司）；恒温水浴锅HH·S21-8-S（上海跃进医疗器械有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters）。

1.2试剂 95%乙醇（国药集团化学试剂有限公司，AR）；甲醇、磷酸（广东光华科技有限公司，AR）；乙腈（广州市同源化工科技有限公司，色谱纯）；纯化水、超纯水（实验室自制）。

1.2药材 舒肝片（17120230、17120213、18124707，北京同仁堂科技发展股份有限公司）；新橙皮苷（纯度94.7%，110805 -200306，中检院）；柚皮苷（纯度99.2%，111857-201702，中检院）；阴性对照药材采购自地方药店。

2实验条件的选择

2.1提取溶剂优化[9]

取舒肝片（批号：17120230）20片用研钵捣成细粉，过五号筛，用万分之一天平精取4份，0.3 g每份，置于50 ml锥形瓶中，用25.00ml移液管移取甲醇、50%甲醇、70%甲醇、95%乙醇等四种溶液各25.00ml，至常温，称重，加热回流1 h，放冷，分别补足，摇晃均匀后，以滤纸过滤，再过微孔滤膜（0.45 μm）后即得舒肝片不同溶剂提取液4份（以上皆为平行两组实验）。将舒肝片的4种溶剂提取液分别注入色谱仪。结果，95%乙醇的提取效率极低，而随着甲醇浓度下降，提取率增大，50%甲醇提取率最好，且节约溶剂，降低污染，故50%甲醇为最佳。

2.2提取方法优化

用万分之一天平，取的“2.1”项下细粉4份，各0.3 g，放入50ml锥形瓶，用25 ml移液管取50%甲醇25.00ml，摇匀后放置至常温，称重，分别采取恒温水浴锅加热回流和超声清洗器超声各1 h，放冷，补足，先以滤纸滤过，再过微孔滤膜即得舒肝片的不同提取方法的50%甲醇提取液（以上平行两组实验）。液相结果表明，无论是柚皮苷还是新橙皮苷，超声的提取率都高于加热回流，并且超声简单方便，省时省力，安全，故选择超声作为提取方法。

2.3提取时间优化

用万分之一天平称定本品细粉4份，每份0.3 g，放入50 ml锥形瓶，用25 ml移液管移取50%甲醇25.00 mL，放冷后称重，用超声清洗器超声，分别在处理20 min、30 min、45 min、60 min后，放冷，补足，用过滤器滤过，摇晃均匀，再过微孔滤膜（0.45 μm）后即得舒肝片的不同时间处理的50%甲醇提取液4份。结果，30 min时的提取率最高，30 min以后，提取率下降，故30 min最适宜且省时。

2.4检测波长

查阅文献[10-12 ]知283 nm，柚皮苷和新橙皮苷的常用检测波长。283 nm下取柚皮苷、新橙皮苷两者的单一对照品溶液、混合对照品溶液以及供试品溶液分别进样。结果显示283 nm波长下柚皮苷和新橙皮苷的分离度良好，两者峰形都对称，且其他干扰少。

2.5流动相的考察

参考文献[13-14]考察了乙腈与不同浓度磷酸（0.05%、0.1%、0.2%、0.25%）的流动相组合，发现乙腈与0.1%磷酸的组合下，目标峰峰形、分离度都较好。接着考察了不同比例的乙腈与0.1%磷酸（22:80）（21:79）（18:82）（15:85）的组合。结果乙腈-0.1%磷酸（21:79）条件下，柚皮苷和新橙皮苷的分离效果佳，出峰时间在15 min内，几乎无干扰，利于快速检测。以上试验，均在柱温40 ℃情况下进行（进行试验时处于冬天，温度低）。

3 色谱条件与系统适应性试验

3.1色谱条件 色谱柱为安捷伦Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6×250 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸（21: 79）；流速1.0 mL/min；检测波长283 nm；柱温40 ℃；进样量10μL；进样时间15 min，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于3000。

3.2 样品前处理

3.2.1流动相的配置：用移液枪移取磷酸1 ml加超纯水配成1%磷酸溶液，隔膜真空泵抽滤后超声脱气，以乙腈-1%磷酸（21:79）作为流动相。

3.2.2对照品储备液的制备：取柚皮苷和新橙皮苷对照品各10 mg，用十万分之一天平称定，分别用50%甲醇定容至50 ml，即得柚皮苷母液（190.9152μg/ml）和新橙皮苷的母液（219.2320μg/ml）。

3.2.3供试品溶液的制备：将舒肝片（批号：17120213）细粉，取0.3 g，用万分之一天平称定，倒入50ml锥形瓶，用移液管取50%甲醇25 mL，冷却至室温时，称重，用超声30 min后，放冷，补足，摇晃均匀，滤纸滤过，再过微孔滤膜，即得。

3.2.4阴性样品溶液：按《卫生部药品标准中药成方制

剂》第十册中舒肝片的处方配比，配好除枳壳药材的其他十一味药材，同处方工艺制成阴性样品，按“3.2.3”项，同法操作，即得。

3.3专属性考察

按“3.1”色谱条件，取上述对照品溶液、供试品溶液以及阴性溶液，分别进样。实验结果显示舒肝片供试品溶液在6.7~10.0分钟范围内先后出现柚皮苷和新橙皮苷的特征峰，阴性溶液在对应位置没有出现任一峰。表明其余11味药中不含有两个目标成分，阴性无干扰，本实验专属性良好。结果见图1。

图1   A.混合对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照 1柚皮苷2新橙皮苷

3.4线性关系的考察

吸取“3.2.2”项下柚皮苷、新橙皮苷对照品溶液0.1、0.5、1.0、 1.5、2.0、2.5 ｍＬ用50%甲醇定容至10 ｍL，摇晃均匀，即得6份（柚皮苷浓度依次为1.909152 μg/ml、9.54576 μg/ml、19.09152 μg/ml、28.63728 μg/ml、38.18304 μg/ml、47.72880 μg/ml和新橙皮苷浓度依次为2.19232 μg/ml、10.96160 μg/ml、21.92320 μg/ml、32.88460 μg/ml、43.84640 μg/ml、54.80800 μg/ml）的混合对照品溶液，分别按“3.1”色谱条件测定，记录峰面积值。以色谱峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，得柚皮苷回归方程y＝15814x+2776.8，ｒ＝ 0.99975（n=6），线性范围：1.909152～47.7288 μｇ／ｍl（见表4）。新橙皮苷回归方程y＝19514.9x+91.0，r=0.99997 （n=6），线性范围：2.91232～54.808 μg/ml（见表5）。

表4 柚皮苷线性关系的考察

表5 新橙皮苷线性关系的考察

3.5精密度试验

取同一供试品溶液，按“3.1”色谱条件，连续进样６次。柚皮苷和新橙皮苷峰面积的均值分别为456535（RSD=0.5％，n=6）、401480（RSD=0.9 %，n=6），表明实验精密度良好。

3.6稳定性试验

取同一样品溶液，按“3.1”色谱条件，分别在0、2、4、8、16、24ｈ时进样，记录数据。柚皮苷和新橙皮苷峰面积的均值分别为424633（RSD=0.71％，n=6）、373712（RSD=0.66%，n=6），表明供试品溶液中柚皮苷和新橙皮苷的含量在室温下放置24 h内稳定。

3.7重现性试验

取同一批号（17120213）样品６份，用万分之一天平称取各0.3 g，按“3.2.3”项方法操作，按“3.1”项色谱条件进样，记录数据并计算柚皮苷和新橙皮苷的含量，最后结果表明取样量相差不大的情况下，柚皮苷、新橙皮苷平均含量分别为2.2179 mg/mL（RSD=0.52％，n=6）、1.7089 mg/mL（RSD=0.60％，n=6），表明本实验的重现性良好。

3.8加样回收率试验

为了验证本实验所建立测定方法的分析误差和操作过程的损失是否对真实度有影响。取同一批号（17120213）的已知浓度的舒肝片６份，加入同一浓度的对照品溶液，按“3.2.3”项下法制备供试品溶液，按“3.1”项色谱条件进样，计算平均加样回收率。结果表明，柚皮苷、新橙皮苷平均回收率分别为 100.6％（RSD=1.5％）、100.2％（RSD=0.95％），实验测得的回收率均在95%~105%范围内，表明本实验准确度良好。

表9 柚皮苷加样回收试验结果

称样量（g）	加入柚皮苷含量（μg）	测得柚皮苷含量（μg）	回收率（%）	平均(%)	相对标准偏差(%)
0.1501	381.8304	716.2807	100.23	100.6	1.5
0.1501		714.3075	99.89
0.1504		718.6782	100.92
0.1509		714.6512	99.92
0.1504		723.5382	101.96
0.1509		719.4985	100.90

表10 新橙皮苷加样回收试验结果

称样量（g）	加入新橙皮苷含量（μg）	测得新橙皮苷含量（μg）	回收率（%）	平均(%)	相对标准偏差(%)
0.1501	381.8304	700.0401	101.04	100.2	0.95
0.1501		699.4438	101.02
0.1504		693.2408	99.53
0.1509		689.1491	98.63
0.1504		698.4573	100.56
0.1509		698.9627	100.60

3.9样品测定

取同仁堂三批（17120230、17120213、18124707）舒肝片，每个批号的供试品平行取两份，按本实验建立的方法进行操作，进样并计算柚皮苷和新橙皮苷的含量。同批样品测定结果偏差较小，测定结果较稳定。结果见表11。

表11 舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷的测定

批号	柚皮苷的含量(mg/片)			新橙皮苷的含量(mg/片)
	1	2	RSD(%)	1	2	RSD(%）
17120230	2.1174	2.0894	0.93	1.44	1.44	0.45
17120213	2.2749	2.3328	1.78	1.73	1.74	0.28
18124707	2.1797	2.1504	0.96	1.46	1.44	0.88

4讨论

4.1预实验过程中发现乙醇的提取率相对甲醇差很多，可以剔除，参考文献中较常用的纯甲醇的提取率也不是很理想，后改变甲醇的浓度，发现甲醇浓度降低后，柚皮苷和新橙皮苷的提取率大大增加。最终选用50%甲醇作为提取溶剂

4.2首先参考《中国药典》中的流动相发现目标峰拖尾严重，调整比例后没有改善。后改用乙腈与磷酸溶液的组合更为合适，筛选过程中发现出峰时间随着流动相乙腈比例的增大，逐渐缩短，但乙腈过高时，出峰时间过短，柚皮苷和新橙皮苷分离度变差。乙腈比例过小，容易造成峰拖尾，出峰时间过长。最终乙腈-0.1%的磷酸（21:79）最佳。

4.3工艺流程对中成药中某药材的主成分在成药中的含量多少有巨大影响。舒肝片中含有枳壳与陈皮但是预实验过程中发现陈皮的主要成分橙皮苷含量极低可忽略，难以检测。故而放弃了对陈皮的含量测定。

4.4参考含有枳壳且枳壳处理工艺相似的中成药的含量测定方法，对舒肝片中的柚皮苷和新橙皮苷进行含量测定，不确定因素干扰大大减少，实验的能够更顺利地进行。结果表明高效液相色谱法能有效检测舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷的含量，且精密度好，稳定性高，成本低且省时省力，简单操作便于推广。本方法能够为市面上舒肝片的质量控制提供参考。

5 结论

通过实验研究建立了HPLC测定舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷的方法，经方法学验证，本法操作简便，专属性强，稳定性重复性好，适用于舒肝片中柚皮苷和新橙皮苷的测定，即可供舒肝片质量控制参考。

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作者简介：胡爱娣（1996—），女（汉族），理学学士，助理中药师，从事药品检验研究。 Tel：[phone]； Ｅ-mail：[e-mail]