蛋白质纯度分析研究进展

连燕娜马兰张巧巧通讯作者

蛋白质在制备过程中主要会用到物理学，化学，生物学等方面的知识，但是其涉及到的基本原理不仅仅是这两个方面。一方面是混合物中几个组分配率的不同，然后用机械手段（例如层析和结晶）进行分离；另一方面是利用外力将混合液放置在单一物质中，通过如电泳，高速离心，超滤等物理立场的作用，使得各组分分散在不同区域进而进行分离。

1 蛋白质的提取

1.1 水溶液提取法

稀盐及缓冲系统对蛋白质的稳定性比较好、溶解性强而成为目前最常使用的溶剂。一般用量为原物料的1~5倍，提取时必须充分搅动，才能加速蛋白质的溶解。提取温度与有效成分的特性有关。大部分蛋白质的溶解性都随温度的提高而提高，所以在较高的温度下，可以提高蛋白质的溶解性，缩短提取所需要的时间；然而，如果提取过程中的温度过高，蛋白质是非常容易变性或者是失活的，现阶段提取的时候多采用低温（<5℃）提取[1]。另外，由于蛋白质、酶是等电点的两性电解质，所以在提取的过程中提取液的PH值应该控制在偏于等电点两侧更有利于提取。此外，稀盐溶液能够有效保护蛋白质变性的优点，在提取液中可以添加一些中性盐，一般选择0.15摩尔/升的浓度。缓冲液一般采用含磷和碳酸盐类溶液。

1.2 有机溶剂提取法

有些蛋白或酶能与脂类结合，或其分子中含有许多非极性侧链，不溶解于水，不溶解于稀盐溶液，不溶解于酸或碱。以乙醇、丙酮、正丁醇为主要溶剂，对脂蛋白的提取有较好的效果。科恩在1949年首先提出了利用低温酒精提取法获得了丙种球蛋白，并对其进行了初步研究。目前，世界上使用的低温乙醇工艺有两种，一种是在美国使用的 CohnOncley工艺，一种是在西欧使用的 Kistler Nitschman工艺。低温乙醇法被 WHO、中国《生物技术标准》所推荐。该方法不但能实现多组分的分离，而且能实现多组分的同步分离，具有较高的分辨能力和较好的纯化效果[2]。同时，它还能杀菌，清除，失活，但需要在较低温度下使用。用丁醇提取法比从一些与脂肪密切相关的蛋白或酶中提取出更好的效果，一是由于丁醇具有亲脂性，二是由于它能溶于磷脂；其次，丁醇具有亲水性，在一定的溶解度下，不会造成酶的降解或失活；另外，在不同的酸碱度和温度下，正丁醇提取法有很大的选择性。

1.3 酶法

因为米糠中含有大量的纤维素、糖类和植酸酶等组分，因此，在提取过程中，米糠中的蛋白质具有较大的难度。目前，国内外对米糠蛋白质的研究主要集中在强碱性溶液中，存在着提取效率低等问题。蛋白中赖氨酸遇强碱性可与丙氨酸、胱氨酸发生缩合，生成毒性物质，损害肾功能，因此不能再食用。

胡博等人采用酶法从米糠中提取蛋白质[3]。在此基础上，研究了以戊聚糖复合酶和碱性蛋白为主要组分的使用，脱脂米糠蛋白质的提取率为91.6%。提取的相关条件：在0.9%的加酶量、pH值为3.5的酸性条件下、温度50℃的条件下提取3.5个小时；碱性蛋白酶适合在 0.6%的加酶量，pH为8.0、45℃、提取2.5小时的条件下提取脱脂米糠蛋白质，谢宇霞等人通过研究碱法与酶法提取大米蛋白的工艺与功能特征后，发现：在保水性、吸油性、起泡性等方面，相比较酶法，采用碱法来对大米蛋白进行提取更好，虽然采用酶法进行提取比碱法在溶解度与乳化稳定性上都要好[4]，但是通过这两种方式所得到的产品在乳化能力上相差不大。

1.4 反胶团相转移法

反胶团相转移是近二十年来发展起来的一项新技术。该技术是一种基于表面活性剂类分子在特定环境下，通过反向胶团（反胶团）将可溶于水相中的水溶性蛋白分子溶于反胶团的极性核（水池）中，进而使蛋白质转移得以实现，从而实现蛋白质的分离和纯化。反胶团过程中，由于环境中的水分子、表面活性剂等因素的作用，使反胶团过程中的蛋白质分子具有较强的抗粘着性能，同时也具有较强的超活性。

2 蛋白质的纯化

2.1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法

蛋白质的溶解度与溶液中的离子强度，温度等因素有关。在同样的特殊条件下，不同的蛋白质溶解性不同，从而达到分离。三种方法分别是：蛋白质的盐析法，等电点沉淀法，以及在较低温度下用有机溶剂进行沉淀。

中性盐对蛋白质溶解性的影响很大，一般情况下，在较高和较低的盐浓度下，蛋白质的溶解性都有所提高，这就是所谓的盐溶解性；随着盐分的不断升高，蛋白质溶解性有不同程度的下降，并逐步析出。这就是所谓的盐析，也就是在蛋白质的溶液里加入了很多盐[5]。高含量的盐类离子，由于其与水的结合能力很强，能吸附在蛋白质的水化膜上，造成蛋白质的“失水”，从而导致蛋白质粒子的凝聚和结晶。在静电力下，颗粒间的静电力斥力减小，使其溶解性降低。由于不同的蛋白质具有不同的等电点，因此可利用其对酸碱度进行调整，使蛋白质在一定的等电点下沉淀。但该工艺一般不单独应用，多与盐析联合应用。使用一种能与水，甲醇，乙醇，丙酮混合的有机溶剂，能使大部分蛋白

质溶解，从而使其溶解。与盐析相比，这个方法的分辨度要高得多，但是对蛋白质的影响也要大得多，而且需要在较低的温度下进行[6]。戴意强等人利用等电点沉淀的方法，在常温条件下，将大豆蛋白质从提取液中提取出来[7]。

2.2 根据蛋白质带电性质进行分离

在同一 pH值下，因分子质量及电荷数量的不同，导致了不同蛋白质在电场作用下的可移动性。在此基础上，采用了一种由正电极向负电极的聚光等电泳方法。离子交换剂主要有阴、阳离子交换剂两种，将分离出的蛋白质经离子交换剂后，再将其与离子交换剂作用相反的蛋白质吸附到离子交换剂中，再对其进行修饰或所吸收的蛋白质通过离子强度方法被洗脱。叶洲辰等利用双向凝胶电泳，对三种常用的提取方法进行了对比，结果表明双向电泳具有更好的效果[8]。

2.3 根据配体特异性的分离方法—亲和色谱法

亲和层析法是一种高效的蛋白质分离技术，在蛋白质分离领域有着广阔的应用前景，该技术建立具有较高的纯度。基本的原理就是，在组织或细胞中，蛋白质通常都是以一种复杂的混合物存在的，不同类型的细胞中含有的蛋白质种类也不同，对蛋白质进行分离纯化，并对其结构进行表征是生化研究的一个重要环节。目前，还没有一种单一的、套现成的能够从一种复杂的混合蛋白质中分离出某一种蛋白质的方法，只能采用多个方法联合进行。张亚婕等人用离子交换法，凝胶过滤法，亲和层析，反向高效液相色谱法，提取了带沟牛蚂蟥的抗凝蛋白质[9]。

在组织和细胞中，蛋白质往往是以一种复合的形式出现的，而每一种细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。蛋白质的分离与纯化是一个复杂而困难的工作。迄今为止，尚无一种单一、全面的蛋白质提取技术，但通过对其中某一种蛋白质进行适当的分离纯化，可以得到高纯度的蛋白质。蛋白质的分离纯化主要是为了获得更高的纯度和更高的比活。在保证多肽结构完整、高效、快速、纯度的前提下，将需要的蛋白质从其他的成分中分离出来，同时能够保证蛋白质的活性。

参考文献：

[1]曹天丽,郝巨辉,李卫东.蛋白桑叶中蛋白质提取工艺优化及6种蛋白酶酶解物体外降血糖活性分析[J].食品工业科技,2023,44(12):232-241.

[2]吕静,杨洁茹,李坤等.不同提取工艺对油茶籽粕蛋白质结构及功能特性的影响[J].食品工业科技,2023,44(14):102-110.

[3]胡博,高盼,毛燕妮等.酶法辅助提取、纯化米糠蛋白工艺优化[J].中国油脂,2023,48(08):115-120+136.

[4]谢宇霞,吴家乾,黄玉等.碱法提取米糠中粗蛋白的几个影响因素探讨[J].粮食加工,2022,47(03):34-36.

雷海容,刘雷,梁洪祥.超声辅助提取豆粕水溶性蛋白质工艺优化[J].粮食与油脂,2023,36(04):36-39.

[5]程婷婷,李月,李倩倩等.滇产玛卡多糖盐析法脱蛋白工艺研究[J].安徽农学通报,2021,27(20):127-131.

[6]苏雨,张发宇,余金卫等.分段盐析联合两步柱层析纯化巢湖蓝藻藻蓝蛋白[J].安徽农业大学学报,2018,45(03):487-491.

[7]戴意强,刘小莉,吴寒等.不同凝固剂对大豆分离蛋白分子间作用力及蛋白质二级结构的影响[J].食品工业科技,2021,42(12):89-94.

[8]叶洲辰,吴友根,于靖等.海南油茶种仁蛋白质提取及双向凝胶电泳-质谱初步鉴定[J].中国油脂,2020,45(03):103-109+114..

[9]张亚婕. 蚂蟥抗凝血活性蛋白WP-77的分离、纯化与性质表征[D].江苏大学,2022.