蜂王浆提取物长期服用安全性研究

 徐倩孙文文

【摘要】目的：观察蜂王浆提取物急性毒性、遗传毒性和长期毒性。结果：大鼠急性毒性试验结果表明蜂王浆提取物属于无毒物质。细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。长期毒性实验，受试动物一般情况良好，试验结束时雌雄大鼠体重、总增重、总摄食量及总食物利用率与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变（P＞0.05）。结论：蜂王浆提取物连续灌服90天对SD大鼠无不良影响，提示其长期服用具有安全性。

关键词：蜂王浆提取物；大鼠；长期毒性

蜂王浆的独有成分为10一羟基癸烯酸，又叫王浆酸，是蜂王浆的代表物之一。另外，蜂王浆还含有丰富的维生素，如乙酞胆碱、泛酸、叶酸、维生素等，还含有激素、无机盐、有机酸、酶、糖类等多种生物活性物质[1]。我国云南的少数民族早已认识到蜂王浆的宝贵价值，有“蜂宝治百病”之说。现代营养学和医学研究表明，蜂王浆具有延缓衰老、抗癌、增强机体免疫力、调节血液、美容等作用。但国内有关蜂王浆提取物长期服用安全性的报道较少，因此本试验通过动物实验，连续灌胃SD大鼠90天蜂王浆提取物，观察蜂王浆提取物连续灌胃对大鼠的长期毒性，评价蜂王浆提取物长期服用的安全性。

1材料与方法

1.1试验药物蜂王浆提取物，蜂王浆经离心（750r/min、40min）、过滤（200目）、提取（4倍量70%乙醇浸提常温搅拌3h，3倍量70%乙醇常温浸提搅拌2h）、混合、减压浓缩（60±1℃、-0.09±0.002Mpa，1h）、冷冻结晶（55℃时加入3倍量纯水，降温到0-5℃结晶5h）、减压干燥（40±2℃、-0.095±0.002Mpa,10h，水分<3%）等主要工序加工制成，得率约5%，人体推荐剂量1.0g/人/d。

1.2实验动物SPF级昆明种小鼠，体重25～35g，SPF级健康离乳SD大鼠，体重180～220g，雌雄各半。

1.3 试验方法

1.3.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用SPF级健康离乳SD大鼠20只，雌雄各半。急性经口毒性剂量为20.0g/kg.bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

1.3.2 细菌回复突变试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、

TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法、证实试验采用平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变剂对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量为5000μg/皿、1000μg/皿、200μg/皿、40μg/皿和8μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组。首次试验将高剂量组用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组，验证试验将高剂量组用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成10、2、0.4、0.08mg/mL4个剂量组。

1.3.3 哺乳动物红细胞微核试验：选用SPF级昆明种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。因受试物最大使用浓度为0.5g/mL,小鼠灌胃体积按20mL/kg.bw计算，故最高剂量设10.0g/kg.bw，中、低剂量设5.0g/kg.bw、2.5g/kg.bw，同时设溶剂(蒸馏水)对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

1.3.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为15μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放

CO2培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

1.3.5 90天经口毒性试验：

1.3.5.1剂量选择及分组：试验设3个剂量组和一个对照组，剂量组按照人体推荐服用量的100、200、300倍设计，分别为1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw、5.00g/kg.bw，用蒸馏水配置成一定浓度的受试物液，对照组给予等体积的蒸馏水，每日灌胃一次( 1.0 ml/100g·bw) 。

1.3.5.2 方法及时间：采用经口染毒，每日灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

1.3.5.3 数据处理：采用SPSS11.0统计软件对数据分别进行One-way ANOVA分析及Dunnett检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1 大鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠蜂王浆提取物急性经口毒性试验LD50＞20.0g/kg.bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。结果见表1。

表1 急性毒性试验结果

性别	动物数（只）	途径	剂量（mg/kg.bw）	初始体重（g）	第7d体重（g）	第14d体重（g）	出现中毒症状动物数（只）	死亡数
雄	10	经口	20000	206±13	266±18	315±22	0	0
雌	10	经口	20000	201±15	253±17	301±20	0	0

2.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

2.3 90天经口毒性试验：

2.3.1一般情况观察各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。

2.3.2 对大鼠体重、增重及食物利用率的影响以1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw、5.00g/kg.bw三个剂量的蜂王浆提取物经灌胃给予大鼠，连续90天。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。90天喂养结束时，与阴性对照组相比各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。

2.3.3眼部检查:在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化。

2.3.4大鼠尿常规指标:经口给予大鼠不同剂量的蜂王浆提取物90天，测定大鼠尿常规指标。结果各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。

2.3.5大鼠血液学指标:经口给予大鼠不同剂量的蜂王浆提取物90天，测定各剂量组大鼠血液红细胞计数、血红蛋白水平、白细胞计数及其分类等指标、红细胞压积、血小板计数等指标。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。

2.3.6大鼠血液生化指标:经口给予大鼠不同剂量的蜂王浆提取物90天，测定各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05），结果见表1。

表1 蜂王浆提取物对大鼠血液生化指标的影响(±s)（n=10）

性别	检验项目	剂量  (g/kg.bw)
		对照组	1.67	3.33	5.00
雄	丙氨酸氨基转移酶(U/L）	30±4	30±3	29±5	30±4
	门冬氨酸氨基转移(U/L)	117±10	116±12	118±14	117±9
	总蛋白(g/L)	67.5±2.4	66.8±3.0	67.1±2.7	67.9±3.1
	白蛋白(g/L)	33.0±1.3	32.4±1.0	31.9±1.5	33.1±1.2
	碱性磷酸酶(U/L)	140.3±37.9	138.7±34.5	141.2±39.4	137.6±35.0
	谷氨酰转肽酶(U/L)	0.27±0.23	0.28±0.22	0.27±0.19	0.26±0.20
	血糖(mmol/L)	5.09±0.69	4.94±0.87	5.05±0.80	4.75±0.74
	尿素(mmol/L)	4.65±0.54	4.59±0.62	4.57±0.48	4.70±0.70
	肌酐(μmol/L)	39±4	38±5	37±4	38±3
	总胆固醇(mmol/L)	1.54±0.27	1.49±0.35	1.52±0.28	1.51±0.31
	甘油三酯(mmol/L)	0.95±0.25	0.94±0.17	0.90±0.22	0.92±0.18
	钾离子(mmol/L)	4.95±0.32	5.06±0.42	5.04±0.37	5.10±0.40
	钠离子(mmol/L)	138.9±1.5	139.2±1.3	137.9±1.4	139.0±1.7
	氯离子(mmol/L)	98.0±1.3	97.7±0.8	97.5±1.2	98.2±0.9
雌	丙氨酸氨基转移酶(U/L）	28±4	27±5	27±6	26±7
	门冬氨酸氨基转移(U/L)	120±12	119±14	123±15	121±16
	总蛋白(g/L)	71.5±2.3	71.0±3.1	72.3±2.5	72.6±2.7
	白蛋白(g/L)	34.8±0.9	34.5±1.4	33.9±1.6	34.6±0.8
	碱性磷酸酶(U/L)	125.3±31.4	131.3±28.9	127.8±32.2	128.9±40.1
	谷氨酰转肽酶(U/L)	0.37±0.32	0.35±0.36	0.34±0.32	0.35±0.29
	血糖(mmol/L)	5.21±0.80	5.30±0.64	5.13±0.75	5.27±0.73
	尿素(mmol/L)	5.64±0.91	5.73±0.79	5.66±0.54	5.52±0.82
	肌酐(μmol/L)	42±4	44±3	43±3	42±5
	总胆固醇(mmol/L)	1.90±0.28	2.01±0.20	1.86±0.32	1.95±0.24
	甘油三酯(mmol/L)	0.71±0.18	0.69±0.26	0.75±0.16	0.80±0.23
	钾离子(mmol/L)	4.68±0.27	4.72±0.30	4.80±0.19	4.65±0.22
	钠离子(mmol/L)	137.5±1.3	135.4±1.5	136.0±1.7	137.8±1.5
	氯离子(mmol/L)	97.6±0.9	96.9±1.2	97.2±1.3	97.0±1.5

2.3.7大体病理及组织学检查:经口给予大鼠不同剂量的蜂王浆提取物90天，测定各组大鼠心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、卵巢绝对重量及相对重量（脏/体）。结果各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

3结论

本研究针对蜂王浆提取物长期食用安全性进行了研究。在本试验条件下蜂王浆提取物雌、雄性大鼠急性经口毒性试验的LD50大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；蜂王浆提取物以1.67g/kg.bw、3.33g/kg.bw、5.00g/kg.bw的剂量给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，试验结束时雌雄大鼠体重、总增重、总摄食量及总食物利用率与对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）；脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。表明蜂王浆提取物连续灌服90天对SD大鼠无不良影响。为蜂王浆提取物应用于保健食品原料安全性提供了依据。

参考文献

[1] 赵家平．蜂王浆药理作用[J]．29-30.