Sox9在软骨发育和疾病中的调控及作用

刘雨欣   牛啸博通讯作者

1. 内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特市，010000
2. 内蒙古自治区人民医院骨科中心，内蒙古呼和浩特市，010000

摘要：Sox9是维持软骨细胞表型和软骨稳态的关键转录因子之一，其与关节软骨细胞外基质代谢有着密切的关系，它调控着Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Ⅸ胶原、基质金属蛋白酶、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与聚蛋白多糖酶的表达。文章对Sox9在基因、RNA和蛋白质水平上调控的许多关键机制进行综述，以期以Sox9为切入点为软骨形成的调控机制及疾病治疗提供新思路。

关键词：SOX9基因；软骨形成；基因调控

膝关节原发性骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床上最常见的关节疾患之一，好发于中老年，是老年人群中最常见的慢性退行性的关节疾病。本病在40岁人群的患病率为10%-17%，60岁以上为50%，而在75岁以上人群则高达80%。OA是软骨退变性疾病中的重要组成部分，其发病率高、致残率高、医疗费用昂贵。软骨退变性疾病主要特征包括软骨损伤，滑膜纤维化，软骨下骨硬化以及骨赘形成。在临床上,包括创伤、免疫系统疾病、特异与非特异性炎症等因素均会引起关节软骨破坏，诱发软骨退行性变，导致关节活动障碍；而关节软骨是透明软骨，其自身固有的修复增殖能力非常局限。以OA引起的软骨退行性损伤为例，目前临床上，无论口服补充、营养软骨素药物(氨基葡萄糖、软骨素)、关节液补充剂(各种剂型玻璃酸钠)，还是关节镜下清理软骨移植及微骨折术等治疗手段，均不能实现透明软骨的再生修复。因此，从关节软骨退变过程中信号通路的调控出发，寻找可行的干预靶点成为近年来国际研究热点，对于指导临床治疗具有重要的意义。Sox9是维持软骨细胞表型和软骨稳态的关键转录因子之一，其与关节软骨细胞外基质代谢有着密切的关系，它调控着Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、Ⅸ胶原、基质金属蛋白酶、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与聚蛋白多糖酶的表达。鉴于Sox9在软骨形成中的重要调控作用，Sox9 在软骨组织工程中的变化已成为软骨形成的重要检测依据，对于指导临床治疗具有重要的意义。因此通过国内外研究进展，将对 Sox9在软骨形成中的基因、RNA和蛋白质水平上的调控，共同作用伙伴和增强Sox9促软骨形成的方法等作一归纳。

SOX9结构/功能

  与所有20种SOX蛋白一样，Sox9具有SRY相关的高迁移率族(HMG)结构域(Figure 2a)[1]。该结构域穿透DNA小沟，结合与C[A/T]TTG[A/T][A/T]匹配或相似的基序。这一特性与DNA弯曲和蛋白质相互作用能力相结合，建立了转录复合体。该结构域还含有该蛋白的核输入和输出信号。Sox9最初在间充质干细胞中表达，分化为软骨细胞和成骨细胞，其早期表达对于软骨和骨骼的进一步发育至关重要。在整个成年期，Sox9在所有软骨形成祖细胞和关节软骨中的软骨细胞中表达；然而，在软骨内骨化期间，其表达在生长板的肥大区突然下降[2]。在从高营养前期向高营养期过渡期间，Sox9表达突然减少，Sox9在肥大软骨细胞中表达不当的转基因小鼠的表型表明，生长板肥大区Sox9的下调对正常的血管侵袭和骨髓形成至关重要，因此也对软骨内骨化成功至关重要[3]。虽然它在软骨生长板的肥大软骨细胞中表达下降，但在整个生命过程中，仍在健康关节软骨的永久软骨细胞中表达。Sox9是软骨形成所必需的，它确保软骨细胞谱系的定型，是促进细胞存活并转录激活许多软骨特异性结构成分和调节因子的基因。当Sox9基因本身或周围的基因杂合突变时会导致早期致死性的人类骨骼畸形综合征 (campomelic dysplasia，CMPD)[4]一种骨骼形态学综合征，这种疾病的特点是软骨畸形，因此软骨衍生的骨骼结构受到影响，导致严重的人类侏儒症综合征。Sox9主要在软骨细胞中表达，是软骨发育过程中的关键转录因子，对胚胎时期的软骨发育，成熟有着重要的调节作用。启动Sox9基因可促使骨髓间充质干细胞向软骨方向分化，并且在软骨内成骨过程中将Sox9基因转入增殖期软骨细胞。Sox9可激活软骨细胞特征分子如Ⅱ型胶原、aggrecan蛋白等的表达，调控软骨主要基质成分基因，如Col9a1，Col9a2和Col11a2等的表达，从而调控软骨分化。

SOX9的作用和合作伙伴

软骨前冷凝是软骨形成过程中第一个形态学上可识别的步骤。它绝对依赖于Sox9 [5]，但其效应子和其他调控机制在很大程度上仍难以捉摸。最近使用Sox9突变小鼠肢芽的研究表明，Sox9上调特定的自动分泌和旁分泌调节因子以及细胞骨架和肌动蛋白网络成分的基因[6]。这些实施前软骨凝结的候选基因得到充分验证。当浓缩的前软骨细胞分化为早期软骨细胞时，出现明显的软骨形成，这些细胞的主要活性是产生软骨细胞外基质。该步骤需要Sox9和SOX5/SOX6

[7,8]。SOX5和SOX6在结构和功能上彼此非常相似，但与Sox9不同，它们的作用是协同的[8]。它们与活性增强子和与数百个软骨特异性基因相关的超增强子上的Sox9协同结合，从而增强SOX9反式激活能力[9,10]。偶然与普遍表达的基因的启动子和转录抑制的基因位点结合表明，三者也可能上调和抑制比早期软骨细胞中特异性表达的基因更多的基因[10,11]。RUNT-结构域因子RUNX1也有助于明显的软骨形成，并且最近被证明与SOX三重体发生物理相互作用并增强软骨细胞特异性基因的激活[12]。除SOX5/SOX6外，Sox9的合作伙伴可能还包括JUN和FOSL2 AP1因子[13]。GLI、JUN/FOSL2和Sox9之间的协同作用是基于这些因子在软骨细胞增强剂中与Sox9的结合位点频繁的接近的结合位点[9,10]。相反，Sox9可能与FOXA2竞争以延迟终末软骨细胞成熟[14]。这些因子值得进行补充研究，以充分验证这些发现，并可能确定其他因子。

软骨形成过程中SOX9表达的分子调控

在软骨形成过程中，各种因素和信号通路影响Sox9的表达[15,16,17] 。骨形态发生蛋白(BMP)2是软骨形成过程中最先被发现调节Sox9表达的因子之一[18]。在禽类胚胎中，应用外源性BMP2诱导异位软骨形成并上调Sox9表达，而BMP拮抗剂NOGGIN抑制肢体中Sox9表达的诱导。BMP-2在体外诱导Sox9表达的分子机制已经被证明[19]。BMP-2促进原代小鼠胚胎成纤维细胞中Sox9基因组蛋白的乙酰化和甲基化，这表明在软骨发育过程中，染色质重塑和组蛋白修饰会影响依赖BMP-2的Sox9表达。转化生长因子(TGF)-β通过激活典型的Smad和非典型的p38途径稳定软骨细胞中的Sox9[20]。出生后缺失介导非典型TGF-β和BMP信号的TGF-β激活激酶1，增强了Sox9启动子BMP2依赖性激活对小鼠软骨生长的重要性[21]。这些小鼠表现出生长迟缓、严重软骨发育不良以及Sox9及其靶基因(如Col2a1和Acan)表达减少。除BMPs外，Hedgehog信号通路还在各种类型的软骨中诱导软骨分化过程中的Sox9表达[17,22]。例如，Shh诱导Sox9的表达，导致体细胞稳健的软骨形成。在软骨形成分化的初始阶段，TGF-β、BMPs和/或Hedgehog信号通路正向调节Sox9的表达。

软骨形成过程中SOX9蛋白质水平调控

各种翻译后修饰，如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化，调节Sox9的各个方面，如其DNA结合活性、稳定性和核定位[15,23]，这些翻译后修饰在软骨形成过程中显著调节了Sox9对许多靶基因的作用。磷酸化：通过磷酸化可以增强Sox9蛋白与DNA的结合活性及其向核内转运的能力.cAMP依赖性蛋白激酶A (PKA)磷酸化Sox9的丝氨酸S64、S181和S211,在人睾丸来源的癌细胞系中NT2/D1，Sox9的磷酸化可能通过增强其与核导入蛋白-β的结合来增加其核移位，核导入蛋白β将蛋白质从胞质溶胶转移到细胞核中。此外，ROCK1响应TGF-β诱导的Rho信号，在人SW1353软骨肉瘤细胞中磷酸化Sox9的丝氨酸181，上调了SOX9蛋白与DNA的结合活性。甲基化：辅激活子相关的精氨酸甲基转移酶-1 (CARM1)甲基化Sox 9 HMG结构域中的多个精氨酸残基。这可能会破坏Sox9和β-catenin之间的相互作用，从而调节软骨细胞的Cyclin D1表达和细胞周期进程[24]。因此，CARM-1敲除小鼠表现出软骨细胞增殖减少和软骨内骨化延迟，而CARM-1过表达转基因小鼠的软骨发育加快。乙酰化：主要组蛋白去乙酰化酶SIRT1与Sox9相互作用并使其去乙酰化，从而增加其对靶基因(如Acan)的核定位和反式激活[25,26]。SIRT1蛋白水平和活性的升高与软骨特异性基因表达呈正相关，在OA个体中，Sox9在软骨的软骨细胞中被超乙酰化[26]。这些研究表明，Sox9的乙酰化状态会调节其作为软骨形成转录因子的活性。糖基化与泛素化：Sox9蛋白上的K396糖基化可影响蛋白的活性和稳定性，提高Sox9的转录活性，K396也是泛素类主要的修饰蛋白位点，泛素结合至特定的赖氨酸残基上可促进蛋白质降解影响蛋白质胞内转运的能力。E3泛素连接酶E6-AP(也称为UBE3A)与Sox9结合，可能是该蛋白的泛素连接酶。E6-AP直接泛素化Sox9，从而降低其体外稳定性[27]。研究发现，E6-AP在高营养软骨细胞中表达，但在高营养前期软骨细胞中不表达，其中Sox9表达分别较低和较高。一致地，E6- AP敲除小鼠在软骨细胞中表现出增加的Sox9表达和较短的Sox9缺陷肥大区。

软骨形成过程中SOX9mRNA水平调控

Sox9 mRNA在生理条件下不会进行差异剪接或细胞内定位，但是有证据表明它可以被microRNA靶向作用， 即微小的(约20个核苷酸)非编码 RNA。非编码RNA是指一组不能翻译成蛋白质的RNA，包括小核 RNAs、小核仁RNAs、microRNAs(MiRNAs)和lncRNAs

[28]。人Sox9 mRNA的3‘UTR具有6种不同miRNAs的识别位点：miR-101，miR-1/205，miR-590/590-3p，miR-145，miR-300和miR-384-5p。在microRNAs中，miR-145已被广泛研究并直接调节软骨发育过程中的Sox9 mRNA以及OA的发病机制[29,30]。白介素-1β诱导的miR-101直接靶向Sox9的3’非翻译区(3-UTR)，导致大鼠软骨细胞中软骨ECM降解[31]。miR-30a结合到Sox9的3-UTR，miR-30a和Sox9在OA患者的原代软骨细胞中分别下调[32].另外，IncRNA是长度在200-100 000个核苷酸之间的非编码RNA对Sox9的调控机制也逐渐被证实。研究鉴定了一组在人关节软骨中表达的lncRNA，并表明lnc RNA(软骨发生RNA的调节因子，ROCR)可能作为Sox9的上游调节因子[33]。RNA干扰导致的ROCR耗竭会破坏MSCs的软骨形成分化，降低软骨特异性基因的表达，并干扰ECM的形成。

调控SOX9促软骨形成的举措

卓群豪等[34]在体外以慢病毒为载体介导Sox9基因转染骨髓间充质干细胞。通过切断前交叉韧带建立小鼠膝关节骨关节炎模型，将Sox9转染骨髓间充质细胞生理盐水溶液注射入小鼠膝关节腔内。注射后4，8，12周后通过甲苯胺蓝及免疫组织化学染色检测病变关节软骨的修复情况。免疫组织化学染色显示，Sox9转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原表达均强于其他组，结果证明Sox9 转染小鼠骨髓间充质干细胞对小鼠膝关节炎病变软骨修复有促进作用。陈伟达等[35]将川续断总皂苷给予大鼠膝关节骨性关节炎模型相应剂量药物灌胃(灌胃体积1．0 ml /100g)，持续给药4周，测定膝关节软骨细胞miR-19a基因及Sox9、NF-κB基因和蛋白水平，结果证明川续断总皂苷能明显减轻骨关节炎软骨损伤，减轻骨关节炎软骨炎症反应; 其机制与川续断总皂苷可上调miR-19a的表达进而激活Sox9 mRNA和蛋白表达，抑制NF-κBmRNA和蛋白表达有关。赵强等[36]采用伸筋易骨矫形手法治疗膝骨关节炎模型兔，取材后分离膝骨关节软骨细胞体外培养，镜下观察并通过四甲基偶氮唑盐比色法（MMT）对比不同组软骨细胞增殖情况；通过蛋白免疫印迹分析3组软骨细胞Sox9的表达变化。结论证明伸筋易骨矫形手法具有提高软骨细胞增殖速度，增强软骨细胞增殖能力，同时该手法可以提高损伤软骨组织Sox9的表达水平,从而促进软骨细胞的合成代谢。

总结与展望

综上所述，在基因、RNA和蛋白质水平上参与Sox9调控的许多关键机制已经被揭示，但也让我们不由得承认，SOX分子网络可能比目前所理解的要复杂得多，仍有许多机制没有被我们掌握。Sox9在软骨细胞分化的多个步骤中的作用已被相当好地理解，我们仍需做更多的工作和研究来评估Sox9与软骨中具有已知或未知作用的许多基因结合的影响。如何上调Sox9基因的表达来促进软骨形成可能是预防和治疗骨关节炎的一个重要方法。

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作者信息：刘雨欣  内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特市，010000 作者简介：刘雨欣 1998.5 蒙古族 内蒙古通辽市 在读硕士研究生  邮箱[e-mail]  

通讯作者：牛啸博  内蒙古自治区人民医院骨科中心，内蒙古呼和浩特市，010000 作者简介：牛啸博 1983 男 汉族 内蒙古呼和浩特市人，博士， 副主任医师，邮箱：[e-mail]