磁性氧化石墨烯纳米复合材料的制备及其磁性成像研究

李雨函，陈卫红，朱彦泓，赵颖，孟浩然，王春意，宋嘉豪 

本论文是大学生创新创业训练计划项目 ；编号 202310452220 

摘要：磁性纳米粒子-氧化石墨烯复合材料用于细胞MRI 造影剂早已广泛报道。普鲁士蓝染色分析表明，不同浓度Fe3O4-GO纳米复合材料与细胞共孵化可以有效进入HeLa细胞。此外，当每ml细胞溶液约有5×105个细胞且含铁量为8 mg·mL-1，与分散的Fe3O4磁性纳米粒子相比，Fe3O4-GO复合材料能显著增强细胞的核磁共振成像能力。

关键词:氧化石墨烯；Fe3O4纳米颗粒复合材料；核磁共振成像；细胞标记

引言

超顺磁的Fe3O4纳米颗粒广泛用于磁共振成像等生物医学领域、生物分离和高热治疗。1-3核磁共振成像标记细胞的Fe3O4，可以评价观察细胞的位置。4-6由于T2弛豫时间缩短，Fe3O4纳米粒子诱发局部的不均匀性磁场，因此导致区域信号降低强度。为了得到的生物相容性和生理稳定性更好的MIR造影剂，通常需要修饰Fe3O4纳米粒子。有报道，形成四氧化三铁纳米粒子的聚集导致了增强的松弛率(r2).8-11。Ai及其同事发现Fe3O4聚合物胶束T2弛豫(r2 = 169 Fe mM-1 s-1)要大于葡聚糖涂覆Fe3O4纳米颗粒(30-50 Fe mM-1 s-1)。9在体内使用时，Fe3O4的纳米粒子的聚集往往容易发生沉淀现象，在血液中导致循环时间缩短。为了解决以上问题，我们开发了GO为基础形成PEI包覆的Fe3O4磁性纳米复合颗粒，以诱导有效的T2缩短。我们表明，PEI包被的Fe3O4纳米粒子可以锚定到石墨烯片形成集群或聚集，相比于单个的Fe3O4纳米粒子，是可以显著增强MRI对比。

在目前的工作中，四氧化三铁纳米粒子被通过热分解方法制备，将两端带有氨基的生物相容性PEI引入到GO中，使在生理条件下稳定存在，然后通过EDC缩合反应形成酰胺键，将羧基修饰的Fe3O4纳米颗粒固定在上述PEI化GO片上。Fe3O4-GO纳米复合材料具有良好的生理稳定性和低的细胞毒性，而且更重要的是，有效细胞标记。

实验部分

材料试剂：天然石墨购自Alfa Aesar。五羰基合铁(Fe(CO)5)， 1 - 乙基-（3 - 二甲基氨基丙基） 碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 和油酸Sigma-Aldrich公司购买。培养基和胎牛血清购自Invitrogen。 WST-1 从碧云天生物技术研究所购买。所有其他 试剂均为分析纯。

制备DMSA包覆的Fe3O4纳米颗粒。通过(Fe(CO)5)的热分解制备5 nm粒径纳米Fe3O4，然后修饰上DMSA。先用用二辛醚 (20 mL)和油酸(1.92 mL)加入到三颈烧瓶中，并然后加热至110 oC。然后将Fe(CO)5 0.4 mL (3.04 mmol)溶解到另一溶液中，然后加热回流（300 oC）1 h后，得到5 nm的Fe3O4纳米粒子。20 mg的Fe3O4纳米粒子的是溶解于2 mL的甲苯中，然后DMSA（20 mg）和DMSO（2 mL）中的加入到溶液中，并在25°C搅拌12 h。然后将沉淀物用乙酸乙酯洗涤。最后，DMSA包覆的Fe3O4纳米粒子转移到2 mL的超纯水。

Fe3O4-GO复合材料的合成。用三乙胺将10 mL GO（0.5mg·mL-1）调节至pH8.0，向其中加入60 mg EDC，60 mg NHS和4 mL PEI（NH2-PEI-NH2）（1 mg·mL-1）。将反应溶液在室温下搅拌48 h，并将获得的粗产物GO-PEI 纳米材料转移到离心超滤管中，然后用超纯水洗涤三次。将2 mL GO-PEI 纳米颗粒（0.5 mg·mL-1），60 mg EDC，60 mg NHS和4 mL DMSA包裹的Fe3O4（2 mg· mL-1）混合搅拌后过滤，以制备Fe3O4-PEI-GO纳米材料。并将其简称为Fe3O4-GO纳米复合材料，通过离心和超纯水洗涤后获得。从图1TEM表征清晰地看出，Fe3O4纳米粒子分散附着于GO表面。

图1 Fe3O4-GO纳米复合材料TEM图像

WST毒性检测。WST测定用来评估Fe3O4纳米复合材料的细胞毒性。将细胞以每100 mL中1×104个细胞接种在96孔板的培养基中并保持24 h。然后分别在0.25 mg·mL-1，0.5 mg·mL-1，1 mg·mL-1DOX浓度下，将细胞与Fe3O4- GO纳米复合物一起培养24 h，然后用PBS缓冲液冲洗三次，并置于含有10％新鲜胎牛血清的RPMI 1640培养基中。通过WST测定检查细胞相对活性。数据以均用标准差表示。

细胞毒性的Fe3O4-GO复合材料。将HeLa细胞与Fe3O4纳米粒子和Fe

3O4-GO复合材料分别孵育后进行了WST检测。结果发现该Fe3O4纳米粒子表现出非常低的毒性，即使在铁的浓度高达80 µg mL-1 (图 2)。Fe3O4-GO复合材料在不同铁浓度为10，20，40，和80 µg mL-1显示非常低的毒性，相对存活率位 100，94，91，和90％。以上数据表明，相对于单个Fe3O4纳米粒子，Fe3O4-GO复合材料的细胞毒性略有增加，可能是由于材料的PEI含量。所有这些结果表明，在我们的Fe3O4-GO复合材料总体毒性较小，可以用于MRI对比剂，细胞分离和磁性靶向药物递送等生物医学材料方面的应用。

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图2 Fe3O4-GO（黑色）和Fe3O4（红色）孵育24小时的HeLa细胞存活率

活细胞内MRI实验。为了观察Fe3O4-GO纳米复合材料的MRI标记行为，我们使用在各种浓度下的纳米复合材料孵育的HeLa细胞，然后将标记的HeLa移动到磁管，进行MRI扫描。在我们的实验中，发现用纳米复合材料孵育的细胞增强了细胞与背景的对比度，并使它们在MR图像中可见（图3）。纳米复合材料显示出放松率增强，取决于剂量密度，并且能够以8 mg·mL-1的铁浓度检测细胞，细胞密度为在每毫升中有5×105个细胞。Fe3O4-GO纳米复合材料显示出显着增强的细胞成像，同时进行成像和治疗临床结果的能力。

   

图3 T2加权磁共振图像：HeLa细胞（5 × 105个细胞）与Fe3O4- GO复合物在不同浓度下孵育24 h

实验结果

我们制定了一种制备Fe3O4-GO纳米复合材料作为有效MRI造影剂。纳米复合材料通过DMSA包覆的Fe3O4纳米颗粒与PEI修饰的GO通过EDC化学偶联反应合成。如此制备的磁性复合材料显示出良好的生理稳定性并且不影响细胞活力和增殖。更重要的是，与相应的Fe3O4 NPs相比，Fe3O4-GO纳米复合材料显示出明显改善的T2加强了MRI对比度，这可以解释为Fe3O4纳米粒子在GO片上形成聚集体，导致相当大的T2弛豫度增强。这项工作表明Fe3O4-PEI-GO纳米复合材料作为生物相容性和高效细胞MRI造影剂的潜在应用。

参考文献

(1) Le Renard, P. E.; Lortz, R.; Senatore, C.; Rapin, J. P.; Buchegger,F.; Petri-Fink, A.; Hofmann, H.; Doelker, E.; Jordan, O. J. Magn. Magn.Mater. 2011, 323, 1054–1063.

(2) Liu, J.; Qiao, S. Z.; Hu, Q. H.; Lu, G. Q. Small 2011, 7, 425–443.

(3) Jaganathan, H.; Hugar, D. L.; Ivanisevic, A. ACS Appl. Mater.Interfaces 2011, 3, 1282–1288.