简介:
简介:本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Westernblot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P〈0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。
简介:本研究探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对骨髓瘤细胞系U266的生物学效应及其机制。用M1Tr法观察As20,对U266细胞增殖的影响,用流式细胞术、DNA凝胶电泳法分析As2O3对U266细胞凋亡的影响,以RT—PCR法检测2μmol/LAs2O3不同处理时间对U266细胞人端粒酶逆转录酶蛋白催化亚单位(hTERT)mRNA的表达变化,用Westernblot法检测As2O3不同处理时间对U266细胞procaspase-3、bcl-2及hTERT蛋白水平的表达变化。结果表明:As2O3能明显抑制U266细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为2μmol/L;As2O3能诱导U266细胞凋亡,呈现剂量和时间依赖性;2μmol/LAs2O3不同时间处理U266细胞后procaspase-3蛋白及hTERTmRNA、蛋白表达呈时间依赖性降低,而bcl-2蛋白表达未发生变化。结论:As2O3通过改变线粒体跨膜电位,触发了U266细胞的线粒体凋亡途径,导致了caspase-3的活化,最终诱导U266细胞凋亡;hTERT表达下调也是As20,诱导U266细胞凋亡的重要作用机制。