逍遥散对慢性束缚应激大鼠相关脑区GAP-43和Nogo-AmRNA基因表达的调节作用

郝艳坤1王乐秋2袁辉1何志鹏1

【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2010）10-0132-02

现在，随着社会竞争的加剧，抑郁症的患病率呈逐年上升的趋势。近十几年研究发现，社会应激因素，包括重大的灾难性的生活事件、生活中的烦扰及长期的困扰，与认知心理因素相互作用，对抑郁症的发生发展有很大的影响，慢性、低强度、长期的应激源是促进抑郁发生、加速抑郁症发展的主要原因。海马包括齿状回、下托和灰质，是介导应激反应的最重要的脑区之一。慢性应激、海马损害与抑郁症关系密切[1]，慢性长期应激可导致海马的神经细胞的变性和丢失;细胞萎缩、轴突末梢结构改变;细胞再生减少以及突触可塑性降低和囊泡重排。这些原因可能影响突触可塑性的变化，从而引起临床的抑郁表现。本实验用RT-PCR的方法研究慢性束缚应激情况下，GAP-43和NogoAmRNA基因表达在海马和杏仁核的变化，以及逍遥散的影响，以进一步解释慢性束缚应激对突触可塑性的变化机制。

1材料与方法

1.1动物与分组：实验用Ⅱ级雄性(SD)大鼠36只，体重（200±20克）g。购自北京维通利华实验动物研究中心。合格证号码:SCXK-京2002-0003、适应性饲养3天后随机分为7天正常对照组(A组，n=6),21天正常对照组(B组，n=6),7天模型组(C组，n=6),21天模型组(D组，n=6),7天治疗组(E组，n=6),21天治疗组(F组，n=6)6组动物每笼6只群养，饲养于普通级动物房，室内温度保持为(22±2)℃，相对湿度保持为22%，各组大鼠喂常规饲料，自由进食饮水。

1.2药物：实验所用的中药复方选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散(柴胡30g，当归30g，自芍30g，白术30g，茯苓30g，炙甘草15g，生姜10g，薄荷10g)，中药饮片均购自北京同仁堂药店，由中日友好医院制剂室煎煮、浓缩制成药粉备用，用时根据需要用蒸馏水配制成一定的浓度。

1.3试剂与仪器：Trizol为Gibcol公司产品，SuperScriptTMⅢRT为Invitrogen产品，dNTPMix、RandomPrimers、Rnasein为Promega产品，DNAMark、2×TaqPCRMixture购自天根生化科技有限公司;PCR仪为MJResearch公司的MiniCyclerPTC一150型扩增仪。

1.4模型制备及药物干预：以慢性束缚方法[2]制作应激大鼠模型，将大鼠束缚于特制的束缚架上，每日3h，C组、E组为7天，D、F组连续进行21天，A、B组每天拿出放置于各自的饲养箱中3h。自造模第l天开始，A、B、C、D组每日灌服蒸馏水，E、F组在束缚前lh灌服逍遥散，按人体用药量换算成大鼠等效剂量作为大鼠用药量，给药量为5.82g/kg，灌胃容积为1ml/100g体重。

1.5取材：分别于7天、21天造模结束后的第2天，用2％戊巴比妥钠腹腔注射进行深度麻醉(40mg/kg)，迅速断头，在超净台内冰上取脑，分别剥离出海马和杏仁核，按照文[3]方法，再将海马分离为cA1区、CA3区、DG，分别放人1.5mL灭菌的离心管中，埋入干冰粉末中迅速冷冻，-70℃冰箱保存备用。

1.6大鼠海马总RNA的提取和含量的测定：将盛有脑组织(约18-22mg)的离心管中各加700uLTrizol,用手持电动匀浆器匀浆(间断，每隔l0s，匀浆l0s)，室温放置5min后，离心10min(4℃，12000g);吸取上清，加人0.2ml的氯仿，振荡15s，在室温下孵育5一l0min后离心15min(4℃，12000g)，吸取清水相，然后进行RNA沉淀、冲洗、溶解。用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，A260/A280比值低于1.5者弃去。

1.7逆转录反应：采用20uL反应体系，取2ug总RNA，加人500ug/mL随机引物0.4uL，

0mmol/LdNTPMixluL，加人ddH20使总体积达到13.9uL，混合后65℃孵育5min，迅速转至冰上至少lmin，加入5倍First-Strandbuffer4uL，0.lmol/LDTT1uL、RNasein0.5uL、SuperScriptⅢRT0.6uL，充分混合后25℃孵育5min，50℃孵育60min，70℃放置15min，中止反应。

1.8PCR引物设计:引物根据Genebank的序列和参考文[4-5]设计，由上海吉康生物技术有限公司合成，引物序列如下:GAP-43（forward:5’-GGAGCCTAAACAAGCCGATGT-3’，reverse:5’-CGCCATAACAACACCAAGAAAC-3’451bp）,Nogo-A（forward:5’-AGCACAGCTTTGCCCATCA-3’,reverse:5’-TGAGCATCACAGCCTCCTCTT-3’521bp）,β-actin（forward:5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，reverse:5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’300bp）。

1.9PCR扩增目的DNA片段取等量的逆转录反应产物，分别扩增NMDAR2A、NMDAR2B、β-actin基因。25uL反应体系组成为逆转录反应产物1uL、引物各1uL和22uL反应混合物(2倍TaqPCRMasterMix125uL，DEPC-ddH209.5uL)，与上述相同反应体系进行β-actinPCR反应。混匀后离心，进行PCR反应，优化的反应条件为:94℃预变性3min，94℃30，50℃40，72℃延伸1min，72℃5min。各指标的循环次数为:28次。PCR反应结束后，取10uL的PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳。对经过电泳之后的琼脂糖凝胶用TotalLabVl.0凝胶图像分析系统进行光密度分析，以在组织中表达稳定的各β-actin条带作为内参照，用目的基因的光密度与内参照条带的光密度比值为半定量分析数据。

1.10统计方法:统计学分析等运用MicrosoftExcel建库，完全随机化设计、SPSS等软件进行。计量数据以均数±标准差（X±S）表示。两组间比较采用t检验，组内差异采用单因素方差分析（ANOVA），以P<005作为差异存在统计学意义的界限。运用MicrosoftExcel2000软件绘制统计图。

2结果

见表1。

表1GAP-43mRNA表达在各组大鼠海马和杏仁核的

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注：与7天正常对照组比较＊P<0.05，＊＊P<0.01;与21天正常对照组比较＃P<0.05，＃＃P<0.01;与7天模型组比较△P<0.05，△△P<0.01，与21天模型组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01。

从列表看出：①GAP-43mRNA表达在CA1区的比较：与A组比较，C组下调，但没有统计学意义，与C组比较，E组上调，但也没有统计学意义；与B组比较，D组显著下调（p<0.05），与D组比较，F组显著性上调（p<0.05）。在CA3区的比较：与A组比较，C组极显著下调（p<001），与7下调模型组大鼠GAP-43积分光密度极显著下调（p<001），与D组比较，F组极显著上调（p<0.01）。在DG区的比较：与A组比较，C组极显著下调（p<0.01），与C组比较，7天逍遥散组显著上调（p<0.05）；与B组比较，D组极显著下调（p<0.01），与D组比较，F组极显著上调（p<0.01）。杏仁核的比较：与A组比较，C组显著上调（p<005），与C组比较，E组显著下调（p<0.05）；与B组比较，D组极显著上调（p<0.01），与D组比较，F组极显著下调（p<0.01）。

从列表看出:基因表达在CA1区的比较：与A组比较，C组显著上调（p<0.05）；与B组比较，D组显著上调（p<0.05），与D组比较，F组下调,没有统计学意义。在CA3区的比较：与A组比较，C组显著上调（p<0.05），与C组比较，E组下调趋势；与B组比较，D组极显著上调（p<001），与D组比较，F组显著下调（p<0.05）。慢性应激对这里的影响比较明显。在DG区的比较：与A组比较，C组显著上调倾向，与C组比较，E组下调趋势（p<0.01）；与B组比较，D组极显著上调（p<0.01），与D组比较，F组显著下调（p<0.05）。在杏仁核区的比较：与A组比较，C组下调趋势，与C组比较，E组显著上调趋势，都没有统计学意义；与B组比较，D组极显著下调（p<0.01），与D组比较，F组显著上调（p<0.05）。

表2Nogo-AmRNA表达在各组大鼠海马和杏仁核的

相对积分光密度变化（X±S）n=6

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▲注：与7天正常对照组比较＊P<0.05，＊＊P<0.01;与21天正常对照组比较＃P<0.05，＃＃P<0.01;与21天模型组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3讨论

前面已经提及，慢性应激会引起抑郁症，对机体造成危害。应激和抑郁症二者之间有密切的联系，这一点己得到了许多研究的证实[6]。

GAP-43是一种神经元特异性磷蛋白。GAP-43基因长度至少50kb，位于人3号染色体和鼠16号染色体。约15kb长的mRNA（Karns等在基因库登录的GAP-43mRNA全长为1153bp）由三个被分隔开的外显子镶接而成[7]。大致有两类神经元可塑性改变关系着GAP-43表达的变化。首先，神经元形态结构的改变触发GAP-43表达的增加。其次，由LTP和LTD引发的突触效能改变影响GAP-43的磷酸化状态和GAP-43mRNA的表达。相关实验表明，GAP-43mRNA稳定性变化很可能调节GAP-43的表达。活体条件下GAP-43mRNA的水平由转录和转录后调节机制共同作用而决定。GAP-43表达的调控机制尚不清楚。调节GAP-43表达的信号可分为阴性和阳性两种：阴性信号在完好的成熟神经元中抑制GAP-43表达，该信号可能由靶组织持续产生，逆行转运至胞体，在发育过程中当轴突到达相应靶组织时它便发挥作用，抑制GAP-43表达，使轴突生长停止；阳性信号在发育或神经受损时诱导GAP-43表达，它可能由损伤局部细胞外环境（包括雪旺细胞或巨噬细胞释放的某些因子）产生或由胞体产生后沿轴突运输又返回胞体而刺激胞体表达GAP-43。对于这两种信号的本质尚不清楚[8]。神经元外环境，自身特性等因素也可能参与了对GAP-43表达的调控。据文献[9]报道,GAP-43的表达是受调控的,而GAP-43mRNA水平上升可能与诱发神经轴突的再生密切相关。正常状态下GAP-43高表达的海马区在脑损伤机能恢复中的作用引人注意。

研究结果显示，在海马的CA1区，7天的慢性应激对GAP-43mRNA的转录没有影响。而21天模型组的GAP-43mRNA的表达量比对照组明显降低（P<0.05），使用逍遥散复方调节后，GAP-43mRNA的表达量相对升高（P<0.05），说明21天慢性束缚应激明显影响CA1区结构的变化，逍遥散复方有明显的调节作用。在海马的CA3区和DG区，7天和21天的模型组和给药组与对照组相比较，模型组GAP-43mRNA的表达量都明显降低（P<0.01），这说明海马的结构趋于被改变，CA3区和DG区的锥体细胞的增生减少，趋于萎缩。使用逍遥散后，GAP-43mRNA的表达量都明显增加（P<0.01和P<0.05），从结果可以看出，时间越长，对海马的损害愈严重，逍遥散的恢复作用就会减弱。在杏仁核区，模型组GAP-43mRNA的表达不但没有减少，相反，却增加了（P<001），使用逍遥散后逐渐降低（P<0.01）。这是杏仁核特殊功能决定的。说明7天和21天慢性应激过程中，杏仁核的锥体细胞是增加的，过渡的肥大。在慢性应激过程中，虽然削弱了大鼠的空间学习能力，但它却增加了大鼠厌恶学习能力和情绪化，这恰是杏仁核的本质功能。故GAP-43mRNA的表达量在杏仁核区升高，增加了大鼠的焦虑和抑郁的程度。用逍遥散调节后，GAP-43的表达量又重新降低（P<0.01）。这说明逍遥散的靶点在这里很明显。21天的慢性应激比7天慢性应激对大鼠的损害更大，GAP-43mRNA的表达在21天的变化大。临床表现抑郁程度更严重。使用逍遥散调节后，21天的效果更好，这是中药起效慢，但持久的特性。说明海马和杏仁核相关脑区的功能相互联系，相互影响。本研究说明生长锥或突触终末高浓度的GAP-43mRNA部分通过以上途径或机制调节神经突起终末对环境刺激的反应，起到促进神经元生长发育、神经再生和突触重建的作用。逍遥散参与对GAP-43mRNA活性的突触可塑性的调节作用。

逍遥散对其有明显的调节作用，可能与逍遥散抗抑郁的机理有关。逍遥散可能恢复细胞内Nogo-AmRNA的抑制系统，使其重新处于平衡的状态，其机理尚待进一步研究。本实验模型采用的束缚应激模型是一个多因素应激(活动受限、饥饿、抑郁、惊恐等)的复合模型，但情志因素占据重要位置。按照中医形神统一观，形受束缚则情志易郁怒，故理论上认为此种模型符合肝气郁结的病因和发病机理。而我们使用的这种应激源，从实验过程动物的表现可以看出，因束缚的时间较长，每天3小时可能符合肝郁脾虚的模型，也是逍遥散的适应症。通过以上可以看出：用逍遥散治疗，在海马的有些区域和杏仁核收到很好的效果。由于中医药对郁病的治疗具有用药灵活、针对性强、收效快、无毒副作用等特点，近年来求助于中医药治疗者已日趋增多。

参考文献

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