血液的冷冻保存

姜婷李霄楠王宇航宋桂荣董艳杰

【中图分类号】R457.1+4【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）26-0095-02

【摘要】目的讨论血液的冷冻保存。方法对采集到的血液进行冷冻保存。结论当前发达国家，已将冷冻血作为一种特殊血液制剂常规供应临床。冷冻血液保存研究的成功，是血液保存方法上的重大突破，为解决血液长期贮存、保障供血和对稀有血型患者输血以及自身输血创造了条件。

【关键词】血液冷冻保存

血液的冷冻保存研究开始于20世纪40年代。1949年Plige和Smith等人发现甘油对牛精子的冷冻保存有保护作用，从中得到启示。第二年，Smith应用甘油作保护剂冷冻红细胞获得成功。其后，血液冷冻保存的研究迅速发展，但是由于没能解决去除防冻保护剂的问题，临床尚未能得到广泛应用。

1956年，Tullis应用Cohn分离器将防冻剂甘油去除，从而使冷冻红细胞成功地应用于临床。但此方法比较复杂，仍未得到广泛推广。

1963年，Huggins发现红细胞在糖溶液中有可逆性的聚集反应，利用此反应原理，可用糖液洗涤法去除防冻保护剂-甘油。从此以后，冷冻红细胞逐渐临床上得到广泛应用。在以后的研究中，对去除防冻剂的方法又有进一步改进，Meryman等人利用不同浓度梯度的氯化钠洗涤红细胞去除防冻剂，经过不断改进，现在在工艺方法上已日益完善，开创了保存血液的另一重要途径。当前发达国家，已将冷冻血作为一种特殊血液制剂常规供应临床。冷冻血液保存研究的成功，是血液保存方法上的重大突破，为解决血液长期贮存、保障供血和对稀有血型患者输血以及自身输血创造了条件。

一、血红细胞的低温损伤机制

低温损伤机制是冷冻保存血细胞的重要问题之一，解决好这一机制不仅有利于细胞保存，而且还有助于杀伤人类有害细胞。许多学者对此进行研究，提出各种学说，但仍无最后定论，目前在下面几个问题上意见比较一致。

1.盐变性学说10ve10vk等人提出，水结冰时使细胞内外所产生的高浓度电解质作用于细胞膜，引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失，增加了细胞对阳离子的通透性，并使细胞膜上形成一些小孔，冰融化时水进入细胞内引起渗透休克，这是慢速冷冻细胞损伤的主要原因。

2.冰晶的机械作用在快速冷冻时，细胞内形成许多冰晶，冰晶作用于细胞膜，并使细胞膜上产生小孔，使得细胞膜不可逆地丧失其半透性，这是快速冷冻时细胞损伤的主要原因。

3.化学损伤Levitt提出冷冻时，在细胞脱水和溶质浓缩过程中，蛋白质组分异常靠近，最终使蛋白质分子中硫氢基(SH)和二硫键(SS)发生相互不可逆的反应，导致蛋白质变性而引起细胞死亡。

4.细胞的融化反应生物细胞的融化反应比冷冻反应更为复杂，有些细胞冷冻以后完全丧失了渗透反应，有些细胞则表现为一定范围的正常的渗透反应，然后就恢复正常，也有一部分溶解，这是细胞的正常反应。还有一些细胞显示出异常高的渗透反应。对于最好的融化程序，目前尚有争议，但从一些最佳复原生物材料实践来看，慢速冷冻的标本应慢速融化，而快速冷冻的标本则应采用快速融化的方法。

二、冷冻保护剂

1.保护剂的特征

小分子保护剂能自由地通透细胞膜，具有高溶解度及对细胞的低毒性，它们能与水形成氢键，从而是有很高的溶解热。加入保护剂后，可降低溶液的冰点，并增加未冻水量，如果被溶的盐数量一定，未冻水中盐的浓度降低，使细胞处于盐浓度较低的环境中。

有效的保护剂及合适的浓度与最佳升降速率相结合，对血液成分做到了成功的保存。大分子保护剂的保护作用与小分子类似(除了不能穿透细胞外)，能使溶液的冰点降低，增加不冻水量。另外大分子还可能影响冰的形成。

2.冷冻保护剂的种类

冷冻保护剂可根据它们能否穿透细胞膜分为两种，即细胞内保护剂和细胞外保护剂。

细胞内保护剂有甘油、DMSO、葡萄糖、乙二醇、丙三醇、甲醇、乙醇、乙酰胺、甲酰胺等.

细胞外保护剂有乳糖、麦芽糖、木糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，右旋糖酐、白蛋白、羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、甘露醇等。

三、低温血液保存与玻璃化

玻璃化就是生物材料在由液态向固态转化过程中没有相变热产生，也就是没有晶体生成，实际上这很难达到。有人认为冷却速率达到104/秒，颗粒小于5～10nm就不致使生物材料受到冷冻损伤，这就叫玻璃化。

玻璃化是保存生物材料最有效的方法，要想最后解决组织和器官的低温保存，必然通过玻璃化这条途径。要想提高生物材料的冰存成活率，也必须研究生物材料的玻璃化问题。添加冷冻保护剂或快速冷冻生物材料的目的就是使生物材料中的水处于容易达到玻璃化状态。

四、红细胞甘油化、冷冻、融化和去甘油的方法

当前在临床上应用的冷冻红细胞制备方法基本上有两种。一种是慢速冷冻法，即使用高浓度甘油处理红细胞，最终使甘油在红细胞中的浓度大约为40%(W/V)，冷冻条件可以在无需严格控制冷却速率的情况下进行，冷冻和贮存使用-65℃以下机械冰箱即可，解冻需要慢速融化。去除甘油试剂可用糖液聚集法或不同浓度梯度NaCl洗涤法。

另一种制备方法是快速冷冻法，即使用低浓度甘油处理红细胞，使红细胞中最终甘油浓度大约为18%(W/V)，然后将甘油化的红细胞置于液氮中(-196℃)迅速冷冻，再将冷冻后的红细胞放在液氮蒸气中(-156℃)贮存。解冻时需要快速融化。去甘油方法可用不同浓度梯度NaCl，由高渗逐渐过度到等渗分次洗涤。

五、冷冻红细胞的制备方法

冷冻红细胞的制备方法前面已经提及，分为快速冷冻和慢速冷冻两种方法。前者需要大容量液氮罐及制氮设备，目前在我国尚难以推广使用。后者不需要复杂昂贵的设备，只需要大容量冰箱(-65℃)即可，在我国目前条件下比较适用。慢速冷冻法按解冻后洗脱甘油的方法不同，又分为盐液离心洗涤法和糖液聚集洗涤法两种基本方法，虽然方法不同，但原理是相同的，两者均先采用高张溶液使融化的高渗红细胞渗透压达到平衡，接着用逐渐减低的高张溶液进行分次洗涤，最后用含有葡萄糖的等渗NaCl悬浮。

1.慢速冷冻糖液聚集洗涤制备法

此方法由美国人哈金斯(Huggins)发明，1963年应用于临床。

(1)制备方法(国内改进)：

ACD或CPD全血(200ml)

↓离心移出血浆

浓缩红细胞(90～120ml)

↓加等体积甘油化试剂

甘油化红细胞(室温平衡半小时)

↓置-80℃冰箱或干冰贮存

冷冻红细胞

↓37～40℃水浴中融化

解冻红细胞

↓加等体积的50%葡萄糖溶液后，分别再用10%蔗糖溶液500ml洗脱3次，分别去除上清

去甘油红细胞

↓加100ml0.9%NaCl悬浮后，离心去上清，再加100ml0.9%NaCl重新悬浮

悬浮红细胞

↓测上清血红蛋白合格后

临床输用

(2)甘油化：分浆后所得的浓缩红细胞转移到专用洗涤塑料袋中，袋内装有一由塑料管密封的电磁搅拌器，在电磁搅拌器的搅拌下缓缓加入等体积的甘油试剂。

甘油试剂配方

甘油(g/v）79.2%

葡萄糖(g/v）8.0%

果糖(g/v）1.0%

EDTA·2Na0.3%

(3)洗脱甘油：国外均采用5%果糖进行洗脱甘油，因果糖价格昂贵，我国用蔗糖代替果糖比较经济

(4)糖液聚集洗涤法去甘油原理：在pH5.2～6.1的范围内，血浆中的丙种球蛋白与红细胞膜的脂蛋白之间可形成一种可逆性的复合物，当加入非电解质溶液时，如果糖、葡萄糖、蔗糖等由于离子强度减小，离子间引力也减小，与脂蛋白结合的球蛋白之间又可结合，使红细胞聚集成团块沉下来；当加入电解质如生理盐水，可使球蛋白之间的链断开，或升高pH值，也可使丙种球蛋白与红细胞蛋白之间的链断开，使红细胞重新悬浮。

2.慢性冷冻盐液洗涤制备法

美国Meryman首先建立。使用不同浓度梯度的NaCl溶液先由高渗逐渐过度到等渗，可用大容量离心机反复离心或用连续离心机分离，洗脱掉冷冻红细胞的防冻剂，达到去除甘油的目的。此方法比糖液洗涤法经济，回收率高，并且质量好，现在为大多数国家所采用。我国目前多采用大容量离心机分次离心洗涤，同样可达到质量要求。

(1)制备方法(国内)：

ACD或CPD全血(200ml)

↓离心移出血浆

浓缩红细胞(90～120ml)

↓加入160ml57.1%甘油化试剂

甘油化红细胞

↓室温平衡半小时，置-80℃冰箱或干冰中贮存

冷冻红细胞

↓37～40℃水浴中解冻

解冻红细胞

↓加入40ml9%NaCl，再加0.9%NaCl250ml离心去上清，再加0.9%NaCl400～500ml离心去上清,再用0.9%NaCl洗涤一次。

去甘油红细胞

↓加100ml0.9%NaCl

悬浮红细胞

↓检测血红蛋白合格

临床输用

(2)甘油试剂配方：甘油(g/v）57.1%

乳酸钠[M]0.14

氯化钾(mM）5

磷酸氢二钠(mM）5

3.快速冷冻红细胞制备方法美国纽约血液中心Rowe首先建立。

(1)制备方法ACD或CPD全血

↓离心移出血浆

浓缩红细胞

↓加入等体积甘油化试剂

甘油化红细胞

↓-196℃冰冻，液氯蒸汽中贮存

冷冻红细胞

↓45℃水浴中3分钟内完全融化

解冻红细胞

↓利用细胞分离器或标准离心机分次洗涤，加16%甘露醇生理盐水300～350ml离心去上清

一次洗涤红细胞

↓加0.9%NaCl或0.2%葡萄糖的生理盐水1000～2000ml离心去上清

去甘油红细胞

↓加等体积的0.9%NaCl或含有0.2%葡萄糖的生理盐水悬浮

悬浮红细胞

(2)甘油试剂配方甘油(w/v）28%

甘露醇(w/v）3%

氯化钠(w/v）0.65%

六、冷冻红细胞的质量标准

使用的甘油化及洗涤方法不同，其质量标准也略有不同，由于制备技术不断改进，质量标准也在不断提高，现普遍采用的冷冻红细胞质量标准如下：

1.红细胞回收率在80%以上。

2.输入人体24小时后红细胞存活率在70%以上。

3.洗涤后红细胞悬浮液上清血红蛋白不超过1g/L。

4.悬浮红细胞甘油含量在1%以下。

5.悬浮红细胞体外溶血试验*上清液血红蛋白增加不超过50%。

6.ATR、2，3-DPG和红细胞脆性接近正常。

七、冷冻血的特点和临床应用

1.优点

保存期可长达10年。能部分调节血液供求不平衡现象，特别为需要稀有血型输血的患者提供了方便，争取到了抢救时间。平时贮备，一旦需要可立即解冻洗涤，满足患者需要。对于自身输血者，可用此方法预先献血冷冻贮存。需要时解冻洗涤输用。

经过洗涤的红细胞，由于去除了绝大部分白细胞、血小板和血浆蛋白，减少输血副反应。对于血液病、阵发性睡眠性血红蛋白尿，肾功能异常以及心功能不全的患者，输用更为有利。特别是对缺乏IgA而有IgA抗体的患者以及患有严重过敏性输血反应的患者，是理想的制品。

冷冻血的2，3-DPG含量与冷冻前区别不大，接近正常。输入人体后，氧的释放能力比保存血要好，可以立即纠正缺氧，这对于胸外科手术和新生儿换血有利。

冷冻血由于去除了细胞代谢产物，抗凝剂及可能的肝炎病毒，即使大量输注也可避免酸中毒，高钾血症以及减少肝炎的传播。由于去除了抗A抗B抗体，O型血真正做到了万能供血者。

2.缺点

工艺繁琐，成本高，需要一定设备

冷冻红细胞在国外已普遍在临床使用，我国1975年也已研制成功，经过20多年的临床输用，证明安全有效，满足了特殊患者的需要，特别是对稀有血型患者的紧急抢救输血争取了时间，挽救了生命。冷冻血是其它制剂所不能代替的。

参考文献

[1]王鸿利.临床输血指南.上海：全国血液质量管理委员会，1996，34.

[2]肖星甫.输血技术手册.成都：四川科学技术出版社，1992，252.