槲皮素保护镉致大鼠肾小管上皮细胞损伤作用

于博潼，何倩倩，逄佳妮，唐小慧，王会

摘要：目的 以大鼠肾小管上皮细胞为研究对象，探讨槲皮素对镉致损伤细胞增殖及凋亡作用。方法 应用酶标仪、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪，进行细胞毒性及形态学分析，凋亡率及线粒体膜电位检测，胞内钙离子稳态分析 结果 细胞增殖抑制作用有所缓解、凋亡形态学特征细胞减少，细胞凋亡率均随槲皮素浓度和时间增大而降低，细胞线粒体膜电位上升，细胞内游离钙离子浓度减少。结论 槲皮素具有保护镉致大鼠肾小管上皮细胞损伤作用。

关键词：槲皮素；细胞凋亡；肾小管上皮细胞；增殖

镉是一种能在环境和人体中长期蓄积的有毒重金属元素，由于重金属开采、冶炼及其在工业、农业与医药上的广泛应用，人们接触镉的机会增多。镉可以通过呼吸道、消化道进入人体并在体内长期蓄积，肾脏是镉毒性最敏感也是最容易受损的器官，长期接触镉可造成肾脏的损害和机能障碍。槲皮素是一种属于黄酮醇类的黄酮类物质，广泛存在于植物界中。槲皮素可以通过螯合金属离子、清除活性氧以及抑制脂质过氧化等作用来抵抗氧化损伤造成的细胞损伤及死亡。

本文研究了槲皮素保护镉致大鼠肾小管上皮细胞损伤作用，并进一步探讨了其作用机制，为将槲皮素开发成为新型有效的预防和治疗镉中毒的药物奠定理论基础，为镉毒害的预防和治疗提供新的思路和途径。

1材料与方法

1.1材料与试剂

大鼠肾小管上皮细胞购于北京北纳生物技术公司；槲皮素（纯度≥95%）购于Sigma公司；胎牛血清和DMEM 高糖培养基购于 GIBCO 公司；甲基噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)、碘化丙啶 (PI) 购于 Sigma 公司； Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒、JC-1探针购于 BD 公司；Fluo-3/AM购于 Invitrogen公司。

1.2仪器

细胞培养箱(Heraeus)，倒置相差显微镜(Olympus)，酶标仪(Thermo fisher)，流式细胞仪(Beckman)。

1.3方法

1.3.1 细胞培养 

大鼠肾小管上皮细胞培养于含10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中，培养环境为37℃、5% CO2、饱和湿度。当细胞达到70%-80% 融合度时用0. 25% 胰酶消化细胞并传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 药物配制及细胞处理 

CdCl2用DMEM培养液配成0.3µM的工作液，处理细胞，制作染毒细胞模型。槲皮素先用 DMSO 溶解，然后再溶于培养基 （DMSO终浓度小于 0. 5%）。取模型组细胞，分别换用含有4、8 和 16 µM 槲皮素的培养基培养。设对照组 (用DMSO处理，终浓度为 0. 5% )。

1.3.3细胞生长动力学 

取生长状态良好、汇合度为80-90% 的细胞，常规方法消化细胞，制成细胞悬液并计数，置37℃、5%CO2 饱和湿度条件的培养箱中培养。连续8d计数。以培养时间（d）为横轴、细胞密度(个/ml)为纵轴，描绘生长曲线，并计算细胞群体倍增时间。

1.3.4 细胞毒性分析

取180 µL 细胞悬液接种于 96 孔培养板，模型组细胞分别换用含有4、8 和 16 µM槲皮素的培养基培养，设置对照组和模型组，每组设 5 个重复，作用时间分别为 12h、24h、36h、48h，然后每孔加入 MTT 20 µL ( 5 mg/mL，PBS 溶解)，继续培养 4 h，弃培养基。每孔加入 200 µL DMSO，充分振荡，酶标仪于 490 nm 波长处检测吸光度 OD 值。

1.3.4 细胞形态学分析 

细胞接种于六孔板（3. 0×105个/孔），待细胞进入对数生长期，制作细胞染镉模型，分别用4、8 和 16 µM槲皮素处理细胞，并设对照组和模型组。应用倒置相差显微镜观察并拍照。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡率 

收集处理 12 h、24 h、36 h、48 h 的各对照组、模型组和处理组细胞，调整细胞浓度为 5. 0×105 细胞/样品，每个样品分别加入100 µL 缓冲液和 5 µL AnnexinV-FITC 及 5 µL PI。混匀，避光孵育 10 min，流式细胞仪检测。

1.3.6 细胞周期检测 

收集对照组、模型组和处理组细胞，调整细胞浓度为 5. 0×105 细胞/样品，细胞于70% 无水乙醇，4 ℃ 处理12 h。PBS 洗涤2次，加入 0. 5 mL PI 染液，4 ℃ 避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

1.3.7 线粒体膜电位检测

收集对照组、模型组和处理组细胞，调整细胞浓度为1. 0 × 106 细胞/样品，加入 0. 5 mL JC-1 染色液，于培养箱避光孵育 20 min，用37 ℃预热的 PBS 洗涤，0. 5 mL PBS 悬浮，流式细胞仪检测。

1.3.8 细胞内钙离子浓度的测定

收集对照组、模型组和处理组细胞，调整细胞浓度为1× 106 细胞/mL。加入 Fluo-3 /Am (终浓度为 8 µM)，于培养箱避光孵育30 min，期间振荡4次。 用无钙离子 PBS 漂洗 2 次， PBS 重悬至 0. 5 mL，流式细胞仪检测。

1.3.9 统计学方法

应用 SPSS 17. 0 统计软件对数据进行统计分析，正态计量数据用“x ± s”表示，组间两两比较采用 t 检验。P < 0. 05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞生长曲线

细胞生长曲线呈“S”型，细胞经历一段约24h的潜伏期，此后细胞进入对数生长期，第5天细胞数达到最大，第6天细胞生长进入平台期，随后细胞开始退化死亡。

2.2细胞毒性分析 

槲皮素作用模型细胞 12h、24h、36h、48h 后，随着槲皮素素浓度的增大其 OD490值随之增大（OD490值反映的是活细胞数量），显示死细胞数量减少，呈现时效和量效关系。

2.3细胞形态学观察

对照组细胞饱满、立体感好，排列紧密，边缘清晰，细胞折光度好。模型理组细胞出现空泡，胞体缩小，细胞形态模糊不清，空泡及细胞碎片增多。处理组凋亡细胞数目减少。

2.4细胞凋亡率的测定

检测结果显示，随着槲皮素作用时间的延长和浓度的增大，凋亡细胞逐渐减少，且呈时间依赖性和浓度依赖性。

2.5细胞周期检测 

检测结果显示，槲皮素处理镉致损伤的细胞后对细胞周期的作用使得处在G1 期细胞数减少，S 期细胞数增多，G2 期细胞数增多。

2.6线粒体膜电位检测

检测结果显示，经不同浓度槲皮素作用 24 h 后细胞的线粒体膜电位下降程度减小，与模型组比较差异极显著。

2.7细胞内游离钙离子测定

检测结果显示，随槲皮素浓度增大，处理组细胞内游离钙离子浓度逐渐降低，与模型组比较差异极显著。

3 讨论

槲皮素对镉致大鼠肾小管上皮细胞损伤具有保护作用。其机制可能是槲皮素可抑制镉致大鼠肾小管上皮细胞引起的细胞凋亡。

参考文献

[1]吴红赤,杨谦,孟逾冰,等. 槲皮素对镉致大鼠急性肾损伤预防作用的研究[J]. 中国急救医学,2007,27(10):922-924.

通讯作者：王会，男，汉族，副高。

课题名称：锦州医科大学大学生创新创业训练计划项目，编号202010160130。