简介：目的构建含有小鼠Smad4基因和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的慢病毒病毒表达载体,为今后应用该重组慢病毒介导的内耳基因导入和相关的聋病基因治疗奠定实验基础.方法利用基因重组、限制性内切酶酶切及基因测序的方法,构建并鉴定pLenti6.3-Smad4-IRES2-EGFP真核表达质粒;利用脂质体介导转染的方法,将pLenti6.3-Smad4-IRES2-EGFP转染导入293T细胞,荧光显微镜下观察EGFP基因表达情况,利用实时荧光PCR的方法检测小鼠Smad4基因mRNA水平的表达情况.结果经PCR鉴定和基因测序证实了小鼠Smad4基因序列与基因bank中的序列相一致.pLenti6.3-Smad4-IRES2-EGFP质粒转入293T细胞后,荧光显微镜下可见有绿色荧光蛋白表达.293T细胞经慢病毒感染后,其小鼠Smad4基因mRNA表达量增加了66427倍.病毒滴度经测定为2.5×108TU/ml.结论成功地构建了含有小鼠Smad4基因的慢病毒表达载体,并能在293T细胞中表达.

简介：目的检测OPG和RANKL在大鼠鼓室硬化模型中的表达水平，探讨OPG／RANKL系统在大鼠鼓室硬化发病机制中的作用。方法30只健康的成年雄性sD大鼠随机分为两组，造模组20只大鼠，其右耳鼓室内注射浓度为1×10^8CFU／ml的肺炎链球菌液进行造模；对照组10只大鼠，其右耳不干预作为空白对照。在造模后第8周处死大鼠，收集造模组大鼠右耳中有鼓室硬化形成的听泡标本作为鼓室硬化组和对照组大鼠右耳的听泡标本作为对照组，进行免疫组化染色。结果对照组的10只大鼠全部存活到造模后第8周，右侧10耳均未发生鼓室硬化；造模组共有17只大鼠存活至造模后第8周，其右侧17耳中共有13耳发生鼓室硬化。鼓室硬化组鼓室黏膜中的OPG表达水平明显高于对照组（P〈0．05），鼓室硬化组鼓室黏膜中的OPG／RANKL比值明显高于对照组（P〈0．05）。结论OPG／RANKL系统可能在大鼠鼓室硬化的发病过程中发挥调节作用，OPG／RANKL比值增加可能与大鼠鼓室硬化的形成有关。

简介：目的探讨噪声暴露前后凋亡诱导因子（AIF）在大鼠不同回基底膜外毛细胞的表达差异以及与噪声性聋高频听力易损性的关系。方法40只SD大鼠随机分为正常对照组和噪声暴露组：噪声暴露组给予声强为115dBSPL白噪声暴露，每天2小时，连续3天，对照组不予噪声暴露。分别于噪声暴露前1日、暴露后1、3、7、14日对两组大鼠行ABR检测，最后一次ABR检测后对两组大鼠耳蜗基底膜行鬼笔环肽一异硫氰酸荧光素（Phalloidin—FITC）染色。West—emblot和免疫荧光染色法观察两组大鼠耳蜗不同回基底膜处AIF的表达。结果大鼠噪声暴露后与暴露前相比，ABR各频反应阈值于暴露后1天最高，随时间逐渐恢复，14天时趋于稳定，听力低频阈移约10dB，高频阈移有30dB（P〈0．05）；基底膜铺片FITC染色示噪声暴露组底回基底膜毛细胞较顶回缺失严重，且有纤毛排列紊乱并出现融合，而对照组毛细胞排列整齐，纤毛呈v或w型，两组间外毛细胞计数比较差异有统计学意义（P〈0．05）；Westernblot结果示，在正常情况下，顶回基底膜的AIF表达高于底回，噪声暴露后，AIF顶、底回基底膜表达均较对照组相应部位增高，且顶回较底回更为显著（P〈0．05）。结论噪声暴露过程中，AIF在促凋亡的同时更发挥出了氧化还原酶的作用，因而AIF在耳蜗基底膜顶、底回的表达差异，可能是噪声性聋高频听力易损性的分子机制之一。