简介:摘要目的探讨程序性坏死通路受体相互作用蛋白1-受体相互作用蛋白3-混合系列蛋白激酶样结构域(RIP1-RIP3-MLKL)是否参与氟诱导的成骨细胞死亡。方法体外培养人成骨肉瘤细胞株(Saos-2细胞),按如下分组分别处理24、48 h:对照组,氟化钠(NaF)组(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF),程序性坏死抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)组(50.0 μmol/L Nec-1),NaF + Nec-1组(5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF + 50.0 μmol/L Nec-1),采用CCK-8法检测细胞增殖情况,化学比色法检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性。为进一步分析NaF对RIP1-RIP3-MLKL通路的影响,将Saos-2细胞分为对照Ⅱ组和NaFⅡ组(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NaF),分别处理24、48 h,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平。结果各组处理24、48 h时细胞增殖率(%:100.00 ± 0.59、104.90 ± 0.44、104.16 ± 0.41、82.45 ± 1.91、64.59 ± 1.83、103.56 ± 0.41、107.18 ± 0.87、105.35 ± 1.28、89.63 ± 1.20、77.51 ± 1.30,100.00 ± 0.33、107.92 ± 0.44、101.78 ± 1.06、75.45 ± 0.39、57.94 ± 1.17、106.74 ± 0.21、111.85 ± 0.21、107.82 ± 0.68、82.34 ± 0.56、70.19 ± 0.99)比较,差异均有统计学意义(F = 77.13、2 313.43,P均< 0.05)。除10.0 mg/L NaF + Nec-1组处理24 h时细胞增殖率与10.0 mg/L NaF组比较差异无统计学意义(P > 0.05)外,其余各浓度NaF + Nec-1组处理24、48 h时细胞增殖率较对应浓度NaF组均显著升高(P均< 0.05)。Saos-2细胞增殖率与染氟浓度呈负相关(r24 h = - 0.976,r48 h = - 0.969,P均< 0.001)。与对照组比较,各浓度NaF组处理24、48 h时LDH活性均较高(P均< 0.05);且各浓度NaF + Nec-1组处理24、48 h时LDH活性较对应浓度NaF组均显著降低(P均< 0.05)。Saos-2细胞LDH活性与染氟浓度呈正相关(r24 h = 0.985,r48 h = 0.988,P均< 0.001)。与对照Ⅱ组比较,5.0 mg/L NaFⅡ组处理24 h时RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平及处理48 h时RIP3蛋白表达水平均较高;10.0、20.0、40.0 mg/L NaFⅡ组处理24、48 h时RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平均较高(P均< 0.05)。Saos-2细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平与染氟浓度呈正相关(r24 h-RIP1 = 0.881,r48 h-RIP1 = 0.952,r24 h-RIP3 = 0.867,r48 h-RIP3 = 0.938,r24 h-MLKL = 0.758,r48 h-MLKL = 0.907,P均< 0.001)。结论氟通过RIP1-RIP3-MLKL通路直接引起成骨细胞程序性坏死,细胞受损的严重程度与染氟浓度密切相关,Nec-1可以部分逆转氟的影响。
简介:摘要目的探讨程序性坏死特异性抑制剂-1(Nec-1)对心搏骤停后大鼠脑损伤的影响及其机制。方法将24只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、模型组和Nec-1组,每组8只。Sham组仅行一般手术操作,不诱导心搏骤停;模型组采用窒息法诱导大鼠心搏骤停后6 min进行心肺复苏(CPR);Nec-1组于大鼠心搏骤停后立即给予1 mg/kg的Nec-1干预,心搏骤停后6 min进行CPR。各组大鼠于CPR后72 h进行神经功能缺损评分(NDS);采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清S100B水平;采用免疫荧光法观察脑皮质和海马受体相互作用蛋白3(RIP3)的表达,并计算阳性率;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测脑组织RIP3的蛋白表达水平。结果CPR后72 h,模型组大鼠出现明显的脑细胞程序性坏死和脑损伤,表现为:与Sham组比较,NDS评分明显下降〔分:57.0(52.7,60.0)比80.0(80.0,80.0),P<0.05〕,血清S100B水平明显升高(ng/L:44.9±4.5比18.6±1.5,P<0.05),脑皮质和海马RIP3阳性率均明显增加〔脑皮质:(31.7±4.8)%比(11.6±3.2)%,海马:(28.4±0.8)%比(10.9±0.6)%,均P<0.05〕,脑组织RIP3蛋白表达水平明显升高〔RIP3蛋白(RIP3/GAPDH):0.708(0.642,0.722)比0.408(0.253,0.504),P<0.05〕。而给予Nec-1干预后,大鼠脑细胞程序性坏死和脑损伤均得到明显改善;与模型组比较,Nec-1组大鼠CPR后72 h NDS评分明显升高〔分:70.5(68.5,71.7)比57.0(52.7,60.0),P<0.05〕,血清S100B水平明显下降(ng/L:31.9±2.7比44.9±4.5,P<0.05),脑皮质和海马RIP3阳性率均明显降低〔脑皮质:(23.7±4.1)%比(31.7±4.8)%,海马:(20.4±0.4)%比(28.4±0.8)%,均P<0.05〕,脑组织RIP3蛋白表达水平明显下降〔RIP3蛋白(RIP3/GAPDH):0.437(0.379,0.507)比0.708(0.642,0.722),P<0.05〕。结论Nec-1可通过抑制RIP3蛋白表达改善脑细胞程序性坏死,从而减轻心搏骤停后大鼠脑损伤。
简介:【摘要】接连发表的大量研究文献证实,细胞坏死是遵循精细化调控机制的程序性细胞死亡过程发生方式。在细胞凋亡生理机制无法正常执行,导致细胞必须发生死亡结果条件下,细胞坏死调控生理机制将会作为细胞凋亡生理机制的替补角色,进入激活生理状态。程序性细胞死亡生理机制的启动过程,通常需要依赖肿瘤坏死因子受体家族物质和Toll样受体家族物质发挥的作用,且借由与受体蛋白物质具备相互作用关系结构的两种蛋白激酶RIP1物质和RIP3物质具体传递细胞死亡生理信号,全面归集并且磷酸化处置MLKL物质,且MLKL物质作为细胞死亡生理过程的具体执行者,能够具体诱导细胞发生坏死结果。文章将会围绕程序性细胞坏死的分子机制及其在炎症中的作用,展开简要的阐释分析。
简介:摘要目的评价食欲素-A对大鼠脑缺血再灌注时程序性坏死的影响。方法清洁级健康成年雄性SD大鼠30只,体重280~320 g,采用随机数字表法分为3组(n=10):假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注组(I/R)组和食欲素-A组(OA组)。I/R组和OA组采用经食管心脏起搏诱发心跳骤停并行心肺复苏的方法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。OA组于造模前10 min时静脉注射食欲素-A 30 μg/kg (用PBS稀释成0.5 ml),Sham组和I/R组于造模前10 min时静脉注射PBS 0.5 ml。于再灌注24 h时行神经功能缺损评分(NDS),然后处死大鼠取双侧海马组织,HE染色后观察海马CA1区锥体细胞形态结构,计数正常椎体细胞;采用Western blot法检测海马CA1区受体相互作用蛋白1(RIP1)、RIP3和混合系列蛋白酶样结构域(MLKL)的表达水平;采用免疫组化法计数海马CA1区RIP1、RIP3和MLKL阳性细胞;采用黄嘌呤氧化酶法测定海马SOD活性,硫代巴比妥酸法测定海马MDA含量。结果与Sham组比较,I/R组和OA组海马CA1区正常椎体细胞计数减少,NDS升高,RIP1、RIP3和MLKL的表达上调,阳性细胞计数增多,海马MDA含量升高,SOD活性降低(P<0.05);与I/R组比较,OA组海马CA1区正常锥体细胞计数增多,NDS降低,RIP1、RIP3和MLKL的表达下调,阳性细胞计数减少,海马MDA含量降低,SOD活性升高(P<0.05)。结论食欲素-A减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制程序性坏死有关。
简介:摘要目的观察PC12细胞X线照射后有无程序性坏死,检测受体相互作用蛋白3(RIP3)的表达变化及其对程序性坏死的调控作用。方法PC12细胞经不同剂量照射后在不同时间点通过乳酸脱氢酶(LDH)释放检测其坏死。程序性坏死特异性抑制剂Nec-1预处理后,通过LDH检测细胞坏死变化。免疫印迹(WB)检测照射干预后RIP3的表达情况。RIP3特异性抑制剂GSK’872预处理后通过LDH检测细胞坏死变化。通过WB筛选RIP3敲低效果最佳的转染序列。将细胞分为对照组、照射组、溶媒对照组、空载对照组和预处理组,采用WB、免疫荧光染色、MTT、LDH和AnnexV-FITC/PI流式检测分析。结果细胞经4 Gy照射后培养3 h细胞坏死程度相对最大,RIP3蛋白表达增加。Nec-1、GSK’872和RIP3基因敲低预处理后,细胞坏死减少。结论4 Gy照射可诱导PC12细胞出现程序性坏死,照射后培养3 h作用最明显;RIP3参与放射诱导PC12细胞的程序性坏死过程,并且发挥重要的正向调控作用。
简介:摘要目的系统评价程序性细胞死亡1受体(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂的心脏毒性。方法检索国内外有关数据库(截至2019年3月2日),收集PD-1/PD-L1抑制剂单药或联合其他方案治疗肿瘤的临床试验,采用国际通用的Cochrane协作网偏倚风险评估工具进行方法学质量评价,采用RevMan 5.3软件进行meta分析,比较PD-1/PD-L1抑制剂(试验组)与安慰剂或其他抗肿瘤药物(对照组)心脏毒性的发生率。结果共纳入了10项随机对照试验(RCT),9项为PD-1抑制剂单药或联合其他抗肿瘤药物的研究,1项为PD-L1抑制剂单药治疗的研究,共包括5 291例患者,其中试验组3 022例,对照组2 269例患者。质量评价结果显示,10项RCT中4项为高偏倚风险,6项为低偏倚风险。meta分析结果表明,试验组心脏毒性发生率显著高于对照组[1.13%(34/3 022)比0.22%(5/2 269),相对危险度=2.38,95%置信区间:1.19~4.78,P=0.01],差异有统计学意义。结论PD-1/PD-L1抑制剂有导致心脏相关不良事件的风险,临床应用中应警惕。
简介:摘要目的探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是否通过诱导肾小管上皮细胞发生程序性坏死和凋亡促使肾小管上皮细胞过度丧失。方法选取6~8周龄C57BL/6雄性小鼠,将其随机分为对照组(n=10)和AngⅡ诱导的高血压肾损害模型组(n=30),通过皮下植入的渗透性微型泵分别持续给予0.9%无菌生理盐水或AngⅡ(1.5 μg·kg-1·min-1)14 d(n=10)、21 d(n=10)和28 d(n=10)。采用qPCR和病理染色法分别检测AngⅡ诱导的不同时间点模型组小鼠肾组织中RIP3、MLKL和caspase-3 mRNA和蛋白的表达。流式细胞术和Western印迹法分别检测不同浓度(10-10~10-5 mol/L)AngⅡ处理HK-2细胞的凋亡和坏死情况及RIP3、MLKL和cleaved caspase-3的蛋白表达。将HK-2细胞分为对照组、AngⅡ诱导组、程序性坏死特异性抑制剂Nec-1(100 μmol/L)组和凋亡抑制剂zVAD(10 mol/L)组,采用免疫荧光检测各组HK-2细胞TUNEL和RIP3中的阳性表达。结果qPCR和免疫组化染色检测结果发现,AngⅡ诱导14 d后模型小鼠肾组织caspase-3 mRNA和cleaved caspase-3蛋白表达均明显高于对照组、21 d模型组和28 d模型组;AngⅡ诱导21 d后RIP3、MLKL mRNA和蛋白表达均明显高于对照组、14 d模型组和28 d模型组。PAS染色结果显示,与对照组相比,AngⅡ诱导的高血压肾损害小鼠肾小管呈明显的坏死形态学特征。流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,各浓度的AngⅡ均可诱导HK-2细胞发生程序性坏死和凋亡(均P<0.05),但10-9 mol/L AngⅡ组细胞坏死率最高,而10-7 mol/L AngⅡ组细胞早期凋亡率最高。Western免疫印迹分析结果显示,与对照组相比,各浓度的AngⅡ组RIP3、MLKL和cleaved caspase-3表达均增高,在10-9 mol/L AngⅡ组RIP3和MLKL表达最高,而cleaved caspase-3在10-7 mol/L AngⅡ组达到峰值(均P<0.01)。免疫荧光结果显示,与对照组相比,AngⅡ(10-9 mol/L)诱导的HK-2细胞中TUNEL+/RIP3+阳性率显著增高(P<0.01);与AngⅡ诱导组相比,Nec-1可有效降低TUNEL+/RIP3+阳性细胞数,而zVAD可促使TUNEL+/RIP3+阳性细胞数目增高(均P<0.01)。结论程序性坏死和凋亡的发生与AngⅡ浓度、caspase活性等因素密切相关,且抑制HK-2细胞凋亡可促使细胞发生程序性坏死。AngⅡ诱导的程序性坏死和凋亡在肾小管上皮细胞进行性丧失中发挥了重要作用。
简介:刑事辩护从单一的实体辩护,发展为实体辩护与程序性辩护并行,乃至程序性辩护先行。面对辩护形态的多元化,对程序性辩护存在认识不足以及过度辩护两种误区。应加强对程序性辩护诉讼原理研究,准确界定程序性辩护特点及诉讼价值。结合司法实践,归纳出程序性辩护八大误区以及应对思路:立法宗旨理解不到位,望文生义确定程序违法;不当放大程序瑕疵,过度进行程序性辩护;程序性辩护顾此失彼,缺乏连贯性和完整性;辩护目标不清,不能准确界定证明对象;忽视程序违法程度差异,辩护缺乏“硬道理”;没有以“证”质“证”,证据形式定位不当;滥用程序性辩护,“质疑”不成反被“质疑”误;有错就辩、小错大辩,程序公正观念绝对化。研究应对程序性辩护思路和方法,避免程序性辩护误区,提高庭审诉辩能力。
简介:摘要程序性死亡受体1(PD-1)是一种主要由活化的T细胞表达,介导免疫抑制的重要免疫检查点受体,抑制PD-1与其特异性配体——程序性细胞死亡配体1(PD-L1)相互作用,即阻断PD-1/PD-L1通路抑制活化T细胞凋亡的免疫治疗,在治疗恶性肿瘤、改善患者预后方面具有较大应用前景。甲状腺癌作为最常见的内分泌恶性肿瘤,大多数甲状腺癌(如甲状腺乳头状癌)经早期治疗预后良好,但晚期患者的淋巴结转移率高,预后差,其中甲状腺未分化癌更是甲状腺癌患者死亡的主要原因。近年来,已有较多研究证实在甲状腺肿瘤中PD-1/PD-L1的表达与肿瘤免疫逃逸之间的关系,因此,现就PD-1/PD-L1表达预测甲状腺癌复发、淋巴结转移及预后价值,对甲状腺癌免疫治疗作用及应用前景进行综述。