简介:摘要目的探讨吸烟对矽肺患者肺泡巨噬细胞(AMs)自噬的影响。方法2019年12月,采用随机抽样选择2017年8至12月在中国煤矿工人北戴河疗养院进行治疗并行大容量全肺灌洗术的42例男性矽肺患者(矽肺贰期19例、叄期23例)作为调查对象。根据其吸烟指数的不同(吸烟指数=每天吸烟支数×吸烟年数),将其分为高(吸烟指数>400)、中(200≤吸烟指数≤400)、低(吸烟指数<200)以及不吸烟组,采用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测各组自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)、Beclin1、p62和凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平,分析吸烟对矽肺患者肺泡巨噬细胞自噬活动的影响。结果与中、低吸烟组和不吸烟组比较,高吸烟组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1、自噬降解底物蛋白p62、凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论吸烟可加重矽肺患者AMs自噬降解障碍,可能通过加重AMs凋亡加速矽肺纤维化的发病进程。
简介:摘要目的探讨烟曲霉对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)自噬流的影响。方法灭活烟曲霉体外诱导小鼠BMDM不同时间(0、0.5、4、12 h),提取细胞蛋白,Western印迹法检测自噬关键蛋白LC3-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)Ser2481的蛋白水平。用烟曲霉和溶酶体阻断剂[包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d+胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴佛洛霉素-A1(BAF-A1)、氯化铵、氯喹]单独或联合体外诱导小鼠BMDM不同时间(4、12 h)后,Western印迹法检测烟曲霉对新生的LC3-Ⅱ、细胞基础自噬流的影响,并通过共聚焦荧光显微镜观察烟曲霉与LC3、Rubicon(RUN domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich-domain-containing protein)的共定位关系。不同处理时间数据结果采用非匹配t检验分析,烟曲霉孢子和自噬溶酶体阻断剂两因素处理数据结果采用2 × 2析因分析方法。结果Western印迹显示,与对照组(0 h组)比较,烟曲霉体外诱导小鼠BMDM 0.5、4、12 h后细胞内LC3-Ⅱ表达逐渐增加,差异均有统计学意义(t值分别为6.58、3.28、3.02,均P < 0.05),但各组p-mTOR蛋白水平差异无统计学意义(t值分别为0.441、0.477、0.382,P值分别为0.682、0.660、0.722)。与单独氯喹处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合氯喹处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异均有统计学意义(t = 2.13、2.78,均P < 0.05)。与单独氯化铵处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合氯化铵处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异均有统计学意义(t = 2.92、2.92,均P < 0.05)。与单独BAF-A1处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合BAF-A1处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异有统计学意义(t = 2.13、2.13,均P < 0.05)。与单独E-64d + pepstatin处理BMDM 4 h和12 h相比,烟曲霉联合E-64d + pepstatin处理后LC3-Ⅱ进一步增高,差异有统计学意义(t = 2.13、2.92,均P < 0.05)。用钙荧光白荧光标记的烟曲霉孢子刺激BMDM 8 h后,共聚焦荧光显微镜显示LC3、Rubicon主要包绕于烟曲霉周围,与烟曲霉均有共定位关系。结论烟曲霉体外诱导可增加小鼠BMDM基础自噬流。
简介:目的:探讨尼古丁在诱导的小鼠肺泡巨噬细胞自噬及肺炎发生中的作用。方法:通过碘化丙啶(PI)/Hoch.est33258染色法检测尼古丁诱导巨噬细胞MH-S死亡;通过Western印迹和电子透射显微镜检测尼古丁诱导MH-S细胞自噬的发生;采用中性红摄取实验检测尼古丁处理后巨噬细胞的吞噬能力;通过攻毒实验检测尼古丁诱导的肺炎。结果:不同浓度尼古丁作用下PI染色的死细胞呈上升趋势;LC3BⅡ蛋白表达具有尼古丁剂量依赖性,并且1μmol/L的尼古丁能够增强LPS预刺激的MH-S细胞自噬发生。电子透射显微镜结果显示在1μmol/L尼古丁的作用下,细胞内自噬体数量增加;MH-S的中性红摄取能力与尼古丁浓度剂量呈负相关性;尼古丁能够诱导小鼠发生肺炎,并降低小鼠体重。结论:尼古丁能够增强肺泡巨噬细胞的自噬水平,并且可以诱导肺炎的发生,有助于进一步研究吸烟与肺炎的关系。
简介:2016年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给了大隅良典。他是谁呢?大隅良典是日本东京大学的理学博士,他可是一个在行业里鼎鼎大名的人。诺贝尔奖颁发给他是由于他发现了细胞自噬的机制。细胞大家都知道,那自噬又是什么?让我们一一道来。
简介:摘要目的观察调控肿瘤相关巨噬细胞自噬后对大肠癌移植瘤放疗后凋亡的影响。方法药物诱导人单核白血病细胞THP-1(中国科学院上海细胞研究所)分化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)后,流式细胞术检测表面分子;使用雷帕霉素(RAD001),巴弗洛霉素(Bafilomycin a1)上调、下调TAM自噬,蛋白质印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白表达;TAM与大肠癌LoVo(美国组织细胞库)细胞混合接种于BALB/c-nu/nu裸鼠(苏州大学实验动物中心),分为TAM自噬上调组、下调组、未调组,LoVo细胞单独接种为对照组。对荷瘤鼠行8 Gy局部外照射,比较照光前后瘤体病理改变、瘤细胞凋亡变化。涉及数据应用SPSS 17.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示,统计分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果TAM表面CD68、CD204、CD206[(62.32±1.58)%、(33.49±2.11)%、(52.42±2.65)%]表达显著高于THP-1细胞[(39.69±1.59)%、(8.56±1.25)%、(7.93±0.53)%]和仅由PMA作用得到的未活化巨噬细胞[(49.72±1.82)%、(7.90±1.19)%、(14.39±0.85)%,P<0.05]。自噬相关蛋白LC3BⅠ、Ⅱ、ATGs、Beclin-1表达结果证明,利用药物成功上调,下调了TAM自噬。照光后凋亡检测结果表明,TAM自噬未调节组[(25.18±0.37)%]高于LoVo细胞单独接种组[(13.74±0.61)%],上调组[(41.75±1.15)%]高于LoVo细胞单独接种组,下调组[(19.34±0.72)%]高于LoVo细胞单独接种组;自噬上调组凋亡率[(41.75±1.15)%]高于未调组[(25.18±0.37)%]与下调组[(19.34±0.72)%];免疫组织化学结果显示,存活素(Survivin)与Livin在上调组表达最少;照光后凋亡相关蛋白表达显示:与单独接种组比较,混合接种组p53、Smac表达均升高,而Livin表达下降,上调组下降最为显著;混合接种后MRP4表达显著上升,调控TAM自噬后,LoVo细胞中MRP4表达下降,其中上调组中表达显著降低。结论上调TAM自噬可改变大肠癌细胞凋亡相关蛋白表达,诱导放疗后大肠癌细胞凋亡发生,增强大肠癌细胞的放疗敏感性。
简介:摘要目的探究白术内酯-1(ATL-Ⅰ)对矽肺患者肺泡巨噬细胞的作用。方法于2019年12月,利用随机抽样的方法,选择2019年7至9月在中国煤矿工人北戴河疗养院进行治疗的12例男性矽肺患者,收集其肺泡巨噬细胞分为对照组、ATL-Ⅰ组(100 μmol/L)以及二甲基亚砜(DMSO)组(100 μmol/L)。采用酶联免疫吸附试验检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达水平,用蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62、溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)、凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和核因子κB(NF-κB)及其磷酸化型(p-NF-κB)的表达水平。结果与对照组和DMSO组比较,ATL-Ⅰ组肺泡巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的表达明显降低(P<0.05),且p-NF-κB、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也明显降低(P<0.05);但ATL-Ⅰ组NF-κB、LAMP2、p62以及Cleaved caspase-3表达与对照组和DMSO组差异均无统计学意义(P>0.05);对照组与DMSO组的上述指标表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论ATL-1可能减少矽肺患者肺泡巨噬细胞炎症因子的释放,抑制自噬的活性,但未能降低其凋亡水平。
简介:摘要目的研究原代人脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)被登革病毒2型(dengue virus type 2, DENV2)感染后,巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)对腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)自噬信号途径的影响。方法TCID50检测DENV2对C6/36细胞的毒力,RT-PCR检测DENV2感染后HUVEC内病毒NS1基因部分片段;透射电子显微镜观察自噬体结构,Western blot检测不同剂量病毒感染HUVEC后对微管关联蛋白Ⅱ(microtubule-associated proteins Ⅱ,LC3-Ⅱ)表达的影响和不同时间MIF的蛋白质水平变化,分析MIF与自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的相关性;MIF抑制剂和通路抑制剂分别预处理DENV2感染的HUVEC,Western blot检测MIF、AMPK、ERK、mTOR和LC3-Ⅱ蛋白变化,分析MIF与AMPK自噬通路的关联。结果实验用毒株对C6/36细胞的TCID50为10-9.09/ml,被感染的HUVEC内可检测病毒NS1基因部分片段序列。不同剂量病毒感染后,在HUVEC内可形成自噬小体或自噬溶酶体,自噬水平有差异。DENV2感染HUVEC引起MIF和LC3-Ⅱ mRNA水平的变化呈正相关,MIF抑制剂的处理影响通路蛋白AMPK、ERK和LC3-Ⅱ的表达,但几乎不影响MIF的蛋白质水平。结论DENV2感染HUVEC引起的MIF变化可影响自噬水平,MIF通过调控AMPK/ERK/mTOR途径影响自噬。
简介:目的:研究巨噬细胞移动抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor,MIF)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)过程中自噬的影响,并探讨其分子作用机制。方法:利用MIF特异性siRNA瞬时转染H9c2心肌细胞,建立H9c2心肌细胞H/R损伤模型,给予自噬经典抑制剂3-甲基嘌呤(3-MA),蛋白免疫印迹(Westernblot)检测MIF、LC3、Cleavedcaspase-3以及mTOR蛋白的表达。结果:干扰MIF后可抑制H/R诱导的心肌细胞自噬;自噬抑制剂3-MA抑制H/R诱导的心肌细胞自噬,减少细胞凋亡的发生;沉默MIF后可增加H/R过程中p-mTOR的表达。结论:MIF可通过抑制自噬减少H9c2心肌细胞H/R损伤,其作用机制可能与激活mTOR有关。
简介:摘要目的探讨雷帕霉素(RAP)激活M2巨噬细胞(type-Ⅱ macrophage)自噬对大肠癌移植瘤放射敏感性的影响。方法经佛波酯(PMA)单独及联合人重组白介素4(IL-4)诱导人单核白血病细胞THP-1分化为M0和M2型巨噬细胞。使用RAP激活M2自噬,设置巴弗洛霉素(bafilomycin A1)下调M2已被激活的自噬作为对照。将大肠癌LoVo细胞接种于BALB/c-nu/nu裸鼠,待形成直径10 mm瘤体后,利用随机数表法,将18只裸鼠分为M2自噬未激活组、激活组和激活后下调组,LoVo细胞单独成瘤为阴性对照组,每组6只。对荷瘤鼠行2次8 Gy X射线局部照射,分析各组间移植瘤放射敏感性的变化。结果M2巨噬细胞标志物Arg-1、CCL-22的相对表达量显著高于M0巨噬细胞(t=78.77、60.02,P<0.05)。M2自噬未激活组瘤体质量、体积和微血管密度(MVD)[(1.93±0.05)g、(2.14±0.06)cm3、36.37±1.04]较阴性对照组[(1.35±0.05)g、(1.77±0.02)cm3、25.69±1.34]显著提高(t=20.07、14.56、10.92,P<0.05);激活M2自噬后,瘤体重量、体积和微血管密度均显著下降[(0.89±0.03)g、(1.24±0.01)cm3、13.60±1.52](t=44.37、40.32、21.43,P<0.05)。利用巴弗洛霉素下调M2自噬后,瘤体质量、体积和微血管密度有所回升[(1.02±0.07)g、(1.37±0.02)cm3、21.06±1.41](t=4.67、13.79、6.23,P<0.05)。与阴性对照组相比,自噬未激活的M2能够抑制Livin和Survivin在瘤体组织中的表达(t=2.64、7.90,P<0.05);RAP激活M2自噬后,可进一步下调上述蛋白的表达(t=5.43、9.39,P<0.05)。利用巴弗洛霉素下调M2自噬后,Livin、Survivin表达量均有所回升(t=2.80、3.17,P<0.05)。结论利用RAP激活M2自噬,可抑制M2促进肿瘤微血管形成的能力,从而抑制移植瘤生长;同时,通过下调大肠癌移植瘤中抗凋亡基因Livin与Survivin的表达,诱导大肠癌移植瘤放疗后凋亡的发生,提高大肠癌的放射敏感性。
简介:摘要目的探讨白念珠菌菌丝对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)自噬流的影响。方法白念珠菌菌丝分别体外诱导BMDM细胞0.5、4、12 h,以不加菌丝处理的0 h组作为对照,Western印迹法检测各时间点自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及磷酸化雷帕霉素机制性靶蛋白(p-mTOR)的表达。白念珠菌菌丝分别联合4种溶酶体阻断剂,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d+胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴弗洛霉素-A1(BAF-A1)、氯化铵及氯喹,体外诱导小鼠BMDM细胞4、12 h,观察白念珠菌菌丝对BMDM细胞基础自噬流的影响。统计分析采用非配对t检验、析因设计的方差分析及LSD-t检验。结果白念珠菌菌丝体外处理小鼠BMDM 0.5、4和12 h后,与0 h组(0.983±0.030)相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换均增加(1.254±0.118、1.629±0.391、1.598±0.379),差异有统计学意义(t值分别为3.875、2.856、2.804,均P< 0.05),但各组p-mTOR的蛋白表达无明显差异。白念珠菌菌丝联合E-64d + pepstatin体外处理BMDM细胞4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平较E-64d + pepstatin单独处理组明显增高,差异均有统计学意义(t值分别3.691、6.648,均P< 0.05)。与相应溶酶体阻断剂组相比,白念珠菌菌丝联合BAF-A1、氯化铵或氯喹4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平均显著升高(均P< 0.05)。结论白念珠菌菌丝体外诱导可增加小鼠BMDM细胞基础自噬流中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换。
简介:摘要自噬是真核细胞重要的物质降解系统之一,自噬小体将待降解物质包裹于其中并与溶酶体融合,以自噬-溶酶体的方式完成对物质的降解。自噬作为一个动态循环系统参与细胞内物质和能量的代谢并维持细胞稳态。自噬在内耳发育异常、衰老、耳毒性药物、噪声暴露等多种因素引起听力损伤过程中均可能发挥保护作用,有成为感音神经性听力损失治疗靶点的潜力。但也有研究指出耳蜗细胞中的自噬亦是导致细胞死亡的原因之一。我们回顾了自噬与感音神经性听力损失的相关文献,总结自噬在感音神经性听力损失发病机制中的作用,探讨自噬作为干预靶点在感音神经性听力损失防治中的潜在价值。